Кинетика полимеризации фибрина в процессах свертывания крови. 
Теоретический анализ

Полимеры играют важную роль в биологии. С изучения таких полимерных макромолекул как двухнитевая ДНК, миоглобин и гемоглобин, по сути, началось проникновение физических методов рентгеноструктурного анализа в, биофизику. Можнобез преувеличения сказать, что в современной! молекулярной* биофизике центральное место занимают вопросы, связанные1 с, выяснением структуры и функций* биомакромолекул [Волькенштейн, 1975; Блюменфельд, 1977; Рубин, 2004]. Общей особенностью первичной структуры биомакромолекул, как нуклеиновых кислот, так и белков, являетсяих субъединичное строение, при этом вкачестве «мономерных субъединиц выступают нуклеотиды и аминокислоты* соответственно:

В последние годы в биофизике, все большее внимание стало уделяться супрамолекулярным структурам, всевозможным волокнистым материалам, состоящим из актиновых [Borisy, 2000], тубулиновых [Катруха, 2006], коллагеновых [Филатов,. Есипова, 2004— Березовский, Есипова, 1997], фибриновых волокон [Pratt- 1997; Hirota-Kawadobora, 2004; Николаев, 2004].

Волокна указанных материалов со структурной точки зрения представляют собой супрамолекулярные образования, состоящие из биологических макромолекул, как субъединиц. Структурные аспекты пространственной организации супрамолекулярных сетей- (GMC) продолжают интенсивно изучаться [Alberts, 2002].

В связи с задачами регуляции процессов формирования GMC в последние годы все большее внимание начинает уделяться вопросам кинетики [Ризниченко, 2004; Варфоломеев, 1999]. Вопросы кинетики приобретают особую остроту в тех случаях, когда формирование CMC призвано обеспечить ту или иную физиологическую функцию (скажем, остановку кровотечения).

В свете этого понятен интерес специалистов, работающих в области проблем свертывания крови, к работам, направленным на изучение кинетических особенностей полимеризации фибрина. Быстрота формирования фибриновых сгустков в кровотоке во многих случаях имеет решающее значение для остановки кровотечения. Именно поэтому изучение механизмов1 формирования фибриновых супрамолекулярных сетей, так же, как и механизмов их фрагментации и деградации, предпринятое в настоящей работе, представляется важным.

С физико-химической точки зрения образование фибриновых сгустков при свертывании крови (или же плазмы крови), вне всякого сомнения, представляет собой агрегационный переход, при котором кровь, как исходножидкая субстанция, утрачивает способность к течению, превращаясь в желе. Другими словами, при свертывании крови имеет место фазовый1 переход из жидкого в гелеобразное состояние. Теоретическое исследование равновесных и неравновесных фазовых переходов (в том числе и переходов в гелеобразное состояние) имеет долгую историю. Согласно принятой после работ Дж. ВГиббса традиции, такого рода переходы* принято отображать на диаграммах состояний, каждой области которых отвечает устойчивость той или иной* фазы по отношению к флуктуациям.

Проблема, теоретического построения соответствующих диаграмм устойчивости для* неравновесных систем к настоящему времени остается нерешенной в общем виде. Не вдаваясь в анализ всех трудностей построения общей теории неравновесных переходов, отметим, что отсутствие общей теории не может лишить нас решимости исследовать агрегационные переходы в крови с кинетических позиций. Именно такого рода попытка предпринята в настоящей работе. При этом кинетические процессы образования фибриновых макромолекул, их ассоциация в макромолекулярные кластеры, и, в конечном итоге, переход системы в гелеобразное состояние, трактуется в терминах статистических моментов: Другими словами, именно на том языкекоторый сегодня принят в отношении кинетических переходов в неравновесных системах различной природы — от статистической радиофизики [Стратонович, 1961; Рытов, 1976], теории массового обслуживания [Риордан, 1966] до проблем физики открытых систем [Климонтович, 1995] и неравновесной нуклеации [Kleinig, 1999; Lushnikov, 2006].

С этой точки зрения настоящая работа, по-видимому, представляет и определенный общетеоретический интерес. Особенно в той своей части, в которой наряду с ассоциацией макромолекул учитываются процессы фрагментации. Вклад последних в процессы смены кровью своего агрегатного состояния теоретически удалось проследить впервые (см. главу II).

Основной целью данной работы являлось> изучение кинетических механизмов формирования и распада фибриновых супрамолекулярных сетей в системах, в которых скорость наработки собственно мономерных субъединиц (в данном случае фибрин-мономерных макромолекул) регулируется каскадными протеолитическими реакциями, управляющими процессами! наработки тромбина. В’связи с этим в работе определенное внимание уделяется* и современным представлениям о кинетике образования тромбина.

В части 1 главы I дается краткий обзор современных литературных данных о биохимических механизмах активации протеолитических реакций с участием сериновых протеаз, ведущих к наработке тромбинаОбсуждается значение реакций «внешнего» и «внутреннего» путей активации свертывания крови, роль реакций инактивации основных активных факторов, а также значение противосвертывающих реакций с участием протеина С.

Особое внимание в главе I уделяется анализу известных математических моделей, лежащих в их основании посылкам и получаемым выводам. Делается вывод, что в рамках развитых к настоящему времени теоретических подходов к проблеме свертывания крови делается упор на изучение методами формальной кинетики пороговых особенностей генерации тромбина — ключевого катализатора конверсии фибриногена в фибрин, ряда иных биохимически активных факторов, а также некоторых ингибиторов реакций наработки тромбина. При этом увеличение во времени концентрации тромбина трактуется как естественная предпосылка для формирования в дальнейшем фибринового тромба. Это действительно так, в том смысле, что концентрация молекул тромбина определяет скорость наработки фибрин-мономеров в системе.

Однако, если не считать отдельных попыток учесть в той или иной форме реакции ассоциации фибрин-мономеров [Гузеватых, 2000; Guy, Fogelson, Keener, 2007], никакого сколько-нибудь систематического изучения вопросов кинетики полимеризации фибрина к настоящему времени в литературе обнаружено не было (см. главу I). В то же время вопросы кинетики полимеризации применительно к другим биологическим" макромолекулам к настоящему времени достаточно развиты. Состояние дел в этой области кратко анализируется в части 2 главы I настоящей" работы.

Кроме этого, в обзоре литературы подробно рассматриваются подходы к математическому описанию процессов полимеризации, развитые в работах Смолуховского, Флори и Стокмайера. Анализируются критерии гелеобразования. Формулируются принципы математического описания процессов желирования в терминах статистических моментов.

Отдельный раздел главы I посвящен особенностям моделирования полимеризации фибрина. Констатируется, что к настоящему времени для задач о полимеризации/фрагментациифибрина ни одного нетривиального точного решения найти не удалось. Делается вывод о том, что необходим поиск приближенных решений посредством численного исследования редуцированных уравнений, описывающих процессы полимеризации/ фрагментации фибрина. В резюме части 2 главы I сформулированы, пять принципиальных положений, которые, в свете проведенного анализа литературы, представляется целесообразным положить в основу развиваемого в настоящей работе подхода.

В третьей части главы I дается краткий обзор литературных данных, относящихся к вопросам активации внутрисосудистого свертывания за счет протекания патологических процессов в прилегающих к сосуду тканях. В заключительной четвертой части главы I обсуждаются неинвазивные методы, позволяющие в принципе детектировать формирование фибриновых микросгустков в кровотоке. Делается вывод, что увеличение второго момента (М2), имеющее место в ходе реакций полимеризации фибрина, влечет за собой увеличение рассеяниякак ультразвуковых, так и оптических волн. Как следствие, о начальных этапах полимеризации фибрина in vivo и in vitro можно непосредственно следить с помощью ультразвуковых методов. Интенсивность рассеяния волн прямо пропорциональна величине второго момента (М2).

Таким образом ясно, что теоретические описание, позволяющее следить за изменением в. пространстве И' времени моментов распределения молекул фибрин-полимеров, обладает реальной предсказательной силой. Оно позволяет прогнозировать, в каких областях, когда и с какой скоростью должны начаться процессы полимеризации фибрина.

Общие положения такого рода теории* полимеризации/фрагментации фибриновых супрамакромолекул в ходе процессов свертывания* крови сформулированы в главе II настоящей диссертации: Проведенный, в данной главе анализ кинетических аспектов полимеризации/фрагментации фибриновых супрамакромолекул позволил построить искомые диаграммы состояния (см. рис. Н-4 и II-6). В частности, удалось выяснить, что взрывные процессы полимеризации фибрина могут быть инициированы не только запороговой активацией тромбина, но и ослаблением интенсивности фибринолитических процессов при допороговой концентрации тромбина. В главе П1 анализируются пространственные особенности реакции полимеризации фибрина в условиях интенсивного кровотока. Рассматриваются несколько принципиальных постановок, анализ которых позволил прийти к выводу, что пространственное распределение фибриновых микросгустков в кровотоке связано особым соотношением подобия с интенсивностью и местоположением очага активации свертывания крови в прилегающей к сосуду ткани.

Этот теоретический вывод представляет, по-видимому, серьезный практический интерес. Наличие такого рода соотношения подобия позволяет, опираясь на ультразвуковые данные о распределении фибриновых микросгустков в кровотоке, делать предположения о локализации и темпе прогрессии патологических очагов в прилегающих к сосуду тканях. Такого.

Введение

d рода прогнозирование особенно важно в тех случаях, когда патологически^ очаг развивается еще без видимой клинической симптоматики.

В заключительной части работы подводятся общие итоги, формулируются выводы. Обсуждаются естественные ограничения развитого в данной работе теоретического подхода к проблемам полимеризации/фрагментации фибрина. Высказываются соображения о дальнейших вероятных путях развития теории. Дается ряд указаний практического характера, разъясняющих пути экспериментальной проверки развитых теоретических подходов.

Выражаются благодарности лицам и организациям, содействовавшим выполнению настоящей работы.

Выводы.

1. Развито последовательное физико-математическое описание процессов полимеризации фибрина в ходе реакций свертывания крови. Построены параметрические диаграммы устойчивости стационарных состояний рассматриваемой системы (см. рис. II-4, II-6 и II-7), отображающие области параметров, отвечающие жидкому и гелеобразному состоянию крови.

2. Показано, что агрегатные переходы в крови, связанные с гелеобразованием фибрина, могут запускаться не только при запороговой концентрации тромбина, но и при ослаблении фибринолитических механизмов при допороговой концентрации тромбина.

3. Обнаружено, что при запороговой интенсивности фибринолитических процессов гелеобразование фибрина не может быть инициировано даже в результате срабатывания взрывных кинетических процессов наработки тромбина (см. рис. II-9).

4. Установлено, что пространственное распределение множественных фибриновых микросгустков в кровотоке связано особым соотношением подобия с местоположением, темпом развития и интенсивностью очага активации свертывания крови в прилегающей к сосуду ткани.

Благодарности.

Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Георгию Теодоровичу Гурия не только за непосредственную помощь в работе, но и за понимание и готовность всегда пойти навстречу, как бы ни складывались жизненные обстоятельства. Без этого моя научная карьера могла завершиться задолго до написания этой диссертации.

Благодарю своего испанского коллегу, Профессора Мадридского университета Мигеля Эрреро, за плодотворное сотрудничество, особенно за мягкую настойчивость и отклонение нашей совместной работы в область полимеризации.

Спасибо моим коллегам С. Г. Узловой, К. Г. Гурия, О. А. Дудченко, И. А. Романцу, А. С. Рухленко, Е. А. Катрухе и А. Гагариной за совместное обсуждение этой работы в процессе ее выполнения и всем сотрудникам лаборатории криобиофизики ГНЦ РАМН за поддержку и благожелательное отношение.

Благодарю за ценные консультации д.ф.-м.н. М. А. Лившица, заведующего лабораторией физики биополимеров ИМБ РАН.

Автор выражает признательность академику А. И. Воробьеву, директору ГНЦ РАМН, за внимание к работе.

Работа была выполнена при поддержке РФФИ (грант 07−04−1 523-а), Европейского фонда им. Марии Кюри (MRTN-CT-2004;503 361), Международного научно-технического центра (IPP/DOE грант 3744), а также Мадридского университета.

В завершение хочу поблагодарить моего мужа А. С. Злобина за терпение и создание благоприятных условий для выполнения этой работы, а также моих родителей за добрую и трепетную поддержку моих начинаний.

Заключение

убывающих с ростом размера полимера. Однако такая задача трудно, поддается, анализу, как и задача о полимеризации с фрагментацией, для учета которой в данной работе было введено замыкающее соотношение на третий, момент распределения фибрин-полимеров.

Как показало выполнение данной работы, введение замыкающего соотношения оказалось эффективным методом для разрешения задачи. Однако, анализ этого соотношения, проведенный в приложении 1, показывает, что нет единой универсальной формулы замыкающего соотношения, которая бы адекватно подходила ко всем типам полимеризационных схем. Выбранная в данной работе формула замыкающего соотношения приводит поведение исследуемой системы в соответствие с тем, что известно из литературных данных о поведении системы с фрагментацией.

Полученное в главе III соотношение подобия имеет два ярко выраженных разных участка: участок гиперболического спада и участок линейного убывания L с ростом R. Это свойство может служить для интерпретации медицинских данных о состоянии крови в крупных сосудах, получаемых с помощью ультразвуковой техники. Во-первых, если в сосуде имеется облако микротромбов, то логично предположить, что выше по течению имеется источник активации свертывания, например, тканевый патологический очаг. Во-вторых, если в процессенаблюдения за таким, облаком его положении меняется, в частности, облако «ползет» вверх по течению, то это может говорить о росте тканевого источника активации свертывания. Если продвижение облака идет с линейной скоростью, то есть основания полагать, что тканевый патологический процесс находится не на самой ранней стадии своего развития.