Сканирующая ближнепольная и двухфотонная микроскопия нано-и биообъектов

Возможность детектирования и изучения малых объектов чрезвычайно важна для многих научных дисциплин, включая биологические науки и науки о материалах. Для этих целей традиционно использовались различные методы оптической микроскопии. Однако во многих случаях пространственное разрешение оптических микроскопов оказывается недостаточным для детектирования субмикронных объектов. Кроме того, существует теоретический предел пространственного разрешения оптических микроскопов (дифракционный предел), который связан с невозможностью сфокусировать излучение в пятно с диаметром, меньшим примерно половины длины волны используемого светового источника. Для видимого диапазона этот предел составляет около 200−300 нм, что является недостаточным для многих приложений. В последние годы получили интенсивное развитие две новых методики сканирующей оптической микроскопии, позволяющих получать изображения с высоким пространственным разрешением и контрастностью. Первая методика, которая называется сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля, использует для построения изображения, сильно локализованные затухающие электромагнитные поля (называемые также ближним полем), возникающие при прохождении излучения через апертуру оптического зонда, имеющую субдлиноволновый размер. Пространственное разрешение при этом определяется диаметром апертуры зонда, причём изготовление апертур с диаметром в сотни и десятки нанометров представляет собой чисто технологическую задачу. Несмотря на некоторую сложность реализации ближнепольная микроскопия позволяет получать пространственное разрешение, лежащее ниже дифракционного предела.

Вторая методика — это сканирующая многофотонная флуоресцентная микроскопия, развитие которой тесно связано с использованием лазерных импульсов фемтосекупдпой длительности. Благодаря малому времени импульса можно эффективно осуществить многофотонное поглощение при незначительной энергии светового импульса. Это позволяет избавиться от нежелательного фона и увеличить контрастность изображения. Пространственное разрешение многофотонной флуоресцентной микроскопии приближается к дифракционному пределу разрешения. Данная работа посвящена разработке и применению этих методик для изучения двух объектов.

Первым из изучаемых объектов были липофусциновые гранулы (ЛГ) из ретинального пигментного эпителия (РПЭ) сетчатки глаза человека. Это структуры микронного размера, накапливающиеся в клетках РПЭ с возрастом, представляют собой, по существу, недопереваренные лизосомальными ферментами фрагменты наружных сегментов палочек и колбочек сетчатки. Помимо остатков белков и липидов ЛГ содержат более десятка флуорофоров и фотосенсибилизаторов, которые, скорее всего, являются продуктами переваривания ретиналя, высвобождающегося из молекулы зрительного пигмента в результате её фотолиза. Установлена химическая природа только двух флуорофоров — это бис-ретинилиден этаноламин (А2Е)[1] и димер ретиналя с фософатидилэтаноамином[2]. Под действием видимого света липофусциновый гранулы образуют активные формы кислорода, которые в свою очередь способны повреждать белки, липиды, ДНК и инициировать апоптоз клеток РПЭ[3]. Обнаружена корреляция между накоплением в клетках РПЭ липофусциновых гранул и развитием дегенеративных заболеваний сетчатки. Причём свет способен оказывать усугубляющее воздействие на развитие этих заболеваний. Считается, что одним из основных источников фототоксических свойств липофусцина является содержащиеся в нём жёлтые флуорофоры, в частности наиболее известный из них — А2К, для которого известно, что он оказывает фототоксическое действие при облучении синим светом. Тем не менее, механизм фототоксического действия липофусцина остаётся не до конца понятным. Поэтому подробное исследование структуры, спектральных и фотохимических свойств липофусциновых гранул из клеток РПЭ является исключительно важным для понимания патогенеза, разработки мер профилактики и, возможно, способов лечения этих тяжелейших глазных заболеваний. Поскольку размер ЛГ составляет ~1 мкм, для изучения их ультраструктуры необходимо использовать методы микроскопии ближнего поля. Кроме того, для понимания механизма фототоксичности ретинального липофусцина необходимо изучения фотофизических свойств составляющих его флуорофоров и в частности А2Е.

Объектом исследования во второй части данной работы были нанокомпозиты, состоящие из нанокристаллов двуокиси титана, с фотокаталитически высаженными на их поверхность наночастицами золота и серебра (Рис.1).

Рис. 1 Схематическое изображение нанокомпозитных структур металл-ТЮг.

Мезопористые пленки ТЮг благодаря высокой удельной поверхности являются перспективным объектом для применения в фото катализе и фото вол ьтаических элементах[4], В частности благодаря большой ширине запрещённой зоны TiOi, образующиеся при поглощении полупроводником света электрон и дырка имеют потенциалы достаточные для разложения воды в топливных элементах. Однако эффективность фотокатализаторов на основе диоксида титана ограничена двумя факторами[5]. Во-первых, образование электрон-дырочной пары происходит только при поглощении квантов с энергией больше ширины запрещённой зоны ТЮг, равной примерно 3 эВ, что соответствует ближнему УФ-диапазону. Во-вторых, электрон и дырка, как правило, достаточно быстро рекомбинируют, не участвуя в окислительно-восстановительных реакциях. Металлические наночастицы, депонированные на поверхность мезопористых пленок Т1О2, способны улучшить фото каталитические свойства системы[6]. В зоне контакта металл-полупроводник создаётся контакт Шотки, электрическое поле которого способствует разделению образовавшихся в полупроводниковых наночастицах при поглощении света зарядов. Кроме того, металл может служить донором электронов, передавая электроны, возбужденные при поглощении света в зону проводимости ТЮг. В этом случае система металлполупроводник способна проявлять фотокаталитические свойства при поглощении свста видимого диапазона.

Наиболее перспективным представляется применение композитных катализаторов ТЮг с наночастицами благородными металлами в силу большой химической стабильности последних. Подобная система обладает ещё одним, интересным и практически важным свойством. Известно, что для наночастиц золота и серебра под действием излучения оптического диапазона могут возбуждаться так называемые плазмонные колебания — коллективные колебания электронов проводимости под действием электромагнитного поля. Эти колебания обладают наибольшей интенсивностью на определённой частоте, которая называется частотой плазмонного резонанса и для больших сферических наночастиц серебра соответствует длине волны 380 им, а для золота — 520 нм. Плазмонный резонанс приводит к сильному локальному усилению ЭМ поля, и как следствие должен повышать интенсивность рождения электрон-дырочных пар в близлежащих частицах полупроводника, а значит и эффективность композитного катализатора.

Плазмонный резонанс и связанное с ним локальное усиление поля создаёт ещё одно возможную область для применения металл-полупроводниковых нанокомпозитов, а именно в качестве систем для наблюдения рамановского рассеяния. Известно, что рамановское рассеяние является оптическим процессом, интенсивность которого имеет свойство усиливаться на много порядков вблизи металлических поверхностей, что, как считается, является следствием локального усиления электромагнитного поля. Спектр рассеяния представляет собой серию пиков, положение и интенсивность которых определяется химическим строением молекул, на которых происходит рассеяние и является весьма индивидуальной характеристикой химического вещества. Таким образом, рамановский спектр может быть эффективно использован для анализа химического состава. Однако, само по себе рамановское рассеяние имеет весьма малое сечение, поэтому для повышения чувствительности используют эффект поверхностного усиления рассеяния, нанося анализируемый препарат на шероховатые металлические поверхности. При этом величина усиления сильно зависит от конфигурации поверхности. Достаточно актуальной задачей является разработка специальных металлических структур для контролируемого усиления рамановского рассеяния. Особенно полезными такие структуры оказались бы для наблюдения рамановского сигнала одиночных молекул, где требуется большая чувствительность [7]. Благодаря большой плотности отдельно расположенных наночастиц, металл-полупроводниковые нанокомпозиты являются перспективными кандидатами на роль таких структур.

Следует заметить, что для системы полупроводниковых и металлических наночастиц, явление плазмоного резонанса носит сложный характер. Известно, что в шероховатых металлических плёнках наблюдаются так называемые «горячие точки» — области очень сильного локального усиления поля, которое возникает при определённой конфигурации поверхности плёнки. Следует ожидать, что подобное же явление должно появляться и в нашей нанокомпозитной системе. Однако «горячие точки» в металл-полупроводниковых комплексах оставалось до недавнего времени не только неизученным, но и напрямую не наблюдались. Для практических применений композитов металл-полупроводник важно понимание явлений, происходящих при взаимодействии электромагнитного поля с наночастицами, в частности формирования «горячих точек». Кроме того, для оценки возможности применения металл-полупроводниковых композитов для детектирования рамановского сигнала необходимо исследовать явление усиления рамановского рассеяния в подобных системах.

Таким образом, данная работа преследовала следующие цели и задачи:

1. Разработать и реализовать методики ближнепольной и * двухфотонной флуоресцентной оптической микроскопии: собрать оптическую схему экспериментальной установки, обеспечить синхронизацию работы сканирующей платформы с системой регистрации оптического сигнала, создать программное обеспечение для управления сканированием и обработки экспериментальных данных.

2. Методами сканирующей оптической ближнепольной и атомно-силовой микроскопии изучить структуру одиночных липофусциновых гранул и распределение в них различных флуорофоров.

3. Методами двухфотонной сканирующей микроскопии исследовать оптические свойства нанокомпозитных Ti02/Ag и ТЮг/Аи систем в зависимости от параметров возбуждающего импульса (поляризации и длины волны) и характеристик образца, чтобы сделать вывод о механизме усиления поля и появления «горячих точек» в таких системах.

4. Обнаружить усиление рамановского рассеяния для молекул, нанесенных на нанокомпозиты металл-ТЮг и проследить влияние концентрации высаженного металла на величину рамановского сигнала.

Диссертация состоит из 3 глав и заключения. Первая часть представляет собой обзор научной литературы по теме работы. В первой части главы 1 приведено общее описание методов двухфотонной флуоресцентной и ближнепольной сканирующей микроскопии и проведён сравнительный анализ их особенностей. Во второй части дан обзор научной литературы по изучению липофусцина и его роли в фототоксических процессах в организме человека. В третьей части главы 1 описываются общие вопросы, касающиеся оптических свойств металлических наночастиц и их связи с процессами плазмонного усиления поля и гигантского рамановского рассеяния, и затем суммируются приводимые в научной работе результаты исследований металл-полупроводниковых нанокомпозитов. Во второй главе излагаются результаты исследования липофусциновых гранул и флуорофора А2Е. В первой её части описывается применявшиеся экспериментальные методики, во второй — результаты изучения структуры липофусциновых гранул с помощью атомно-силового и ближнепольного микроскопов и также результаты изучения фотофизических свойств А2Е и липофусцина. Третья глава посвящена исследованию металл-полупроводниковых нанокомпозитов. В первой её части описывается экспериментальная установка для двухфотонной микроскопии и для наблюдения рамановского рассеяния, а также процедура приготовления образцов. Во второй части приведены результаты изучения фотопроцессов в металл-полупроводниковых нанокомпозитах. В третьей части описываются эксперименты с рамановским рассеянием на молекулах красителя, нанесенных на металл-полупроводниковую пленку. В заключении сформулированы основные результаты работы.

3.4 Основные результаты.

1. Развита методика, основанная на двухфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии, позволяющая проводить сканирование с регистрацией спектра и кинетики затухания фотолюминесценции. Создано программное обеспечение для управления сканированием и обработки результатов. Показано, что латеральное разрешение микроскопа достигает 400 нм.

2 Обнаружена люминесценция в пористых пленках из нанокристалллов ТЮ2 с фотодепонированными наночастицами золота (серебра) в видимом диапазоне (400 750 нм) при возбуждении системы фемтосекундными импульсами (100 фс) ближнего ИК диапазона (780−920 нм). Показано, что люминесценция проявляется в виде «горячих пятен» в поле микроскопа. Доказано, что люминесценция возбуждается при двухфотонном поглощении. На основе анализа спектра и кинетики затухание люминесценции сделан вывод, что источником фотолюминесценции являются наночастицы металла.

3. Показано, что в «горячих точках» наноструктурированных систем Ti02/Ag и ТЮг/Аи наблюдается усиление электромагнитного поля, которое проявляется как усиление двуфотонной люминесценции. Это усиление обусловлено эффектом ближнего поля в окрестности наночастицы в силу возбуждения локализованного плазмона-поляритона в металле. Дана оценка размера «горячих точек» (10[нм) и усиления поля в «горячих точках» (5−10 раз).

4. Измерена зависимость интенсивности люминесценции «горячих точек» в системах мезопористых плёнок ТЮг с наночастицами золота и серебра от поляризации и длины волны возбуждающего излучения и концентрации высаженного металла. Обосновано предположение, что «горячие точки» представляют собой комплексы из нескольких металлических наночастиц, в которых происходит сильное локальное усиление поля при возбуждении продольной моды плазмонных колебаний.*.

5. Продемонстрирован эффект усиления рамановского рассеяния для молекул родамина В, адсорбированных на пористой пленке ТЮ2 с фотодепонированными наночастицами золота или серебра. Показано, что интенсивность рамановского сигнала нелинейно возрастает с увеличением концентрации высаженного металла. Предположено, что это явление связано с экспериментально наблюдавшейся зависимостью концентрации «горячих точек» от количества высаженного на мезопористую пленку металла.

Заключение

.

В заключении повторим в краткой форме основные результаты диссертационной работы:

1. Развиты методики, основанные на ближнепольной и двухфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии, позволяющие проводить сканирование с регистрацией спектра и кинетики затухания фотолюминесценции. Создано программное обеспечение для управления сканированием и обработки результатов.

2. Методами ближнепольной и атомно-силовой микроскопии наблюдалась неоднородность строения липофусциновых гранул, характерный масштаб которой составляет 100 нм. Неоднородность проявляется в распределении флуорофоров на поверхности единичной гранулы.

3. Обнаружены спектры флуоресценции двух флуорофоров липофусцина, имеющих максимум излучения на 550 и 680 нм соответственно. Показано, что основной вклад в фотолюминесценцию вносит первый флуорофор, представляющий из себя А2Е и его изомер изо-А2Е.

4. Методом фемтосекундной абсорбционной спектроскопии установлены внутримолекулярные процессы переноса энергии в А2Е и определены характерные времена жизни электронных синглетных состояний S2 и Si. Дана оценка вероятности образования нефлуоресцентного продукта реакции.

5. Обнаружена люминесценция в пористых пленках из нанокристалллов ТЮ2 с фотодепонированными наночастицами золота (серебра) в видимом диапазоне (400−750 пм) при возбуждении системы фемтосекундными импульсами (100 фс) ближнего ИК диапазона (780−920 нм). Показано, что люминесценция проявляется в виде «горячих пятен» в поле микроскопа. Доказано, что люминесценция возбуждается при двухфотонном поглощении. Получены экспериментальные данные, согласно которым источником фотолюминесценции являются наночастицы металла.

6. Показано, что в «горячих точках» наноструктурированных систем Ti02/Ag и.

ТЮг/Аи наблюдается усиление электромагнитного поля, которое проявляется как усиление двуфотонной люминесценции. Это усиление обусловлено эффектом ближнего поля в окрестности нанокластера в силу возбуждения локализованного плазмона-поляритона в металле. Дана оценка размера «горячих точек» (Ю'нм) и усиления поля в «горячих точках» (5−10 раз).

7. Измерена зависимость интенсивности люминесценции «горячих точек» в системах мезопористых плёнок ТЮ2 с наночастицами золота и серебра от поляризации и длины волны возбуждающего излучения и концентрации высажденного металла. Обосновано предположение, что «горячие точки» представляют собой комплексы из нескольких металлических наночастиц, в которых происходит сильное локальное усиление поля при возбуждении продольной моды плазмонных колебаний.

8. Продемонстрирован эффект усиления рамановского рассеяния для молекулы родамина В, адсорбированного на пористой пленке ТЮ2 с фотодепонированными нанокластерами золота или серебра.