Методы исследований ионных токов через мембрану изолированных сердечных клеток

Потенциал-зависимые изменения ионных токов через возбудимую мембрану играют ключевую роль в таких важнейших проявлениях деятельности миокарда, как возникновение и проведение возбуждения, сопряжение возбуждения и сокращения. На практике, умение направленно воздействовать на параметры этого процесса может дать эффективные средства борьбы с различными нарушениями сердечной деятельности.

Кринский, 1968, Ходоров, 1980, Розенштраух 1980, е, 1980). Однако, развитию исследований в этом направлении до последнего времени препятствовало отсутствие надежных методов измерения ионных токов. Различные модификации метода фиксации потенциала, разработанные для многоклеточных миокардиальных препаратов оказались б^е^-Сгх, CM. CL Не непригодными для этой цели (. 1977,.

1978). Основные препятствия для реализации надежной фиксации потенциала в исследуемом участке ткани внутренне присущи любому многоклеточному перпарату. Так, сопротивление мендуклеточных пространств оказывается включенным между клетками ткани и электродами измерительной схемы. Попытки скомпенсировать его влияние не привели к успеху, поскольку это сопротивление не одинаково для разных клеток (очевидно, что сопротивление от электрода до клеток, лежащих внутри препарата, больше, чем до наружных клеток). Требование пространственной однородности распределения мембранного потенциала заставляет исследователя ограничивать участок ткани, в котором фиксируется потенциал. Ограничение рабочего участка ткани осуществляется либо методом сахарозного мостика (двойного или одинарного), либо непосредственно препарованием очень маленького кусочка сердечной мышцы (при фиксации потенциала с помощью двух микроэлектродов). При первом способе диффузия сахарозы по междуклеточным щелям приводит к тому, что клетки лежащие внутри ткани, находящейся в рабочем отсеке, омываются не рабочим раствором, а смесью рабочего раствора с сахарозой (в непредсказуемых пропорциях). При втором способе рабочая ткань оказывается окруженной большим количеством поврежденных клеток, что приводит к быстрой ее гибели.

Появление и развитие методов ферментативного выделения изолированных сердечных клеток из сердца взрослых животных I98Qj ЖъМ-Ы^АтО) позволили подойти к решению вопроса об адекватном измерении ионных токов через мембрану. Простая по сравнению с многоклеточным препаратом электрическая структура объекта, непосредственный доступ к мембране позволяют, на первый взгляд, обеспечить надежные измерения токов относительно простыми средствами. Однако, микроскопические размеры объекта приводят к тому, что в измерительной схеме появляются паразитные сопротивления и емкости. Погрешности измерений, вносимые ими, как показал анализ, оказываются столь значительными, что делают невозможным количественное изучение ионной проницаемости. Далее, при измерении малых токов (например, токов через одиночные каналы) исследователи сталкиваются с необходимостью минимизации шумовых погрешностей измерительной схемы (Kw.1/?. 1981). До последнего времени не было проделано систематически строгого математического анализа возможностей и ограничений метода фиксации потенциала как на целой мембране, так и на фрагментах мембран одиночных клеток.

Целью настоящей работы являлось:

— I. Разработать метод получения изолированных сердечных клеток с помощью ферментов, с минимальным риском повреждения.

— 2. Количественно исследовать точность измерения ионных токов в применяемых экпериментальных схемах.

Основные задачи исследования. I. Установить диапазоны концентраций свободного кальция и протеолитических ферментов в растворах, применяемых в процедуре обработки миокарда, которые гарантируют стабильный высокий выход клеток, устойчивых к последующему повышению концентрации кальция во внешнем растворе до физиологического уровня. 2. Провести аналитический и числовой расчет динамики установления потенциала на мембране, уровня и частотных характеристик фоновых шумов при измерении ионных токов, временного и амплитудного разрешения различных методик. 3. Разработать и исследовать в эксперименте конкретные электронные схемы, конфигурацию микроприсоски и экспериментальной установки для достижения максимальной точности регистрации ионных токов.