Бакалавр
Дипломные и курсовые на заказ

Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением

Диссертация: Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Характерная особенность брахиуринов расщеплять молекулу нативного коллагена на две части соотношением размеров 1:3 контролировалась согласно методике. Раствор нативного коллагена человека типа I концентрацией 3 мг/мл инкубировался с коллагенолитическим препаратом концентрацией 1 мг/мл в течении 1 часа (в буфере, содержащем 50 мМ TrisHCl, ЗЮО мМ NaCl, 20 мМ СаС12, 25 мМ ацетата, pH 7.5… Читать ещё >

Содержание

  • 1. ВВЕДЕНИЕ
  • 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 2. 1. ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ МАТРИКС: СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ, КОМПОНЕНТЫ
      • 2. 1. 1. ВВЕДЕНИЕ: ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ МАТРИКС
      • 2. 1. 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МА ТРИКС, А И ИХ ФУНКЦИИ

      2.1.2.1.БЕЛКИ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА.9 2.1.2.1.1 .Коллагены (классификация).9 2.1.2.1,2.Интерстициальные (фибриллярные) коллагены. 10 2.1.2.1.3.Коллаген базальных мембран (IV тип). 11 2.1.2.1.4.Эластин. И 2.1.2.1,5.Фибронсктин.

      2.1.2.1,6.Ламинин компонент базальных мембран.13 2.1.2.1,7.Энтактин (нидоген).13 2.1.2.1,8.Хондронектин.14 2.1.2.2.ПРОТЕОГЛИКАНЫ.14 2.1.3.АРХИТЕКТУРА ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА. 15 2.1.3.1 .ИНТЕРСТИЦИЙ. 15 2.1.3.2.БАЗАЛЫ 1АЯ МЕМБРАНА.15 2.1.4.ЕСТЕСТВЕННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕСТРУКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА. ?

      2.1.4.1 .Необходимость деструкции внеклеточного матрикса.1 8 2.1,4.2.Матриксные металлопротеиназы и прочие протеазы.

      2.1.4.2.1 .ММР — семейство, структура, классификация. Л 8 2.1.4.3.Регуляция активности матриксных металлопротеиназ.21 2.1.4.4.Биологические функции ММР.23 2.2.Процессы переноса макромолекул в некротических тканях.24 2.2.1 .Процессы массопереноса в нормальных и некротических тканях.24 2.2.1.1 .Механизм диффузии.24 2.2.1.2.Механизм фильтрации.

      2.2.1.3.Массообмен в здоровых и некротических тканях.25 2.2.1.4.Механизмы массообмена в нормальных тканях.

      2.2.1.5.Механизмы массопереноса в некротических (ишемизированных) тканях.

      2.2.2.Методы измерения коэффициента диффузии.

      2.2.2.1 .Метод восстановления флуоресценции после фотоотбеливания (РЯАР).

      2.2.2.2.Метод ЯМР-томографии.27 2.2.2.3.Интегральный метод.27 2.2.2.4.Метод перфузии.27 2.2.3. Теория диффузии в тканях и гелях.

      2.2.3.1.Диффузия и другие механизмы массопереноса.29 2.2.3.2.Факторы, определяющие коэффициент диффузии в ткани.29 2.2.3.3.Диффузия в вязких жидкостях.29 2.2.3.4.Влияние макрочастиц на диффузию в тканях.30 2.2.3.5.Диффузия в гелях.30 2.2.3.6.Характеристики тканей.32 2.2.4.Диффузия белков в растворах и тканях (экспериментальные данные).

      2.2.4.1 .В белковых растворах.32 2.2.4.2.Фибриновый сгусток и тромб.

      2.2.4.3.Рыхлая волокнистая неоформленная соединительная ткань (здоровая).

      2.2.4.4.Рыхлая соединительная ткань (в раковой опухоли).34 2.2.4.5.В мышечных тканях.36 2.2.5.Влияние прочих факторов.36 2.2.5.1 .Температура.36 2.2.5.2.Зарядовые взаимодействия.

      2.2.5.3.Хрящевая ткань — роль зарядовых взаимодействий.37 2.3.Некроз ткани вследствие ожога.38 2.3.1.Глубокое ожоговое поражение.38 2.3.2.Первичные изменения в тканях после ож-ога.

      2.3.3.Реактивно-воспалительные процессы: естественная реакция организма на ожог.

      2.3.4. Естественные механизмы регенерации пораженных тканей.40 2.3.4.1 .Ремоделирование матрикса некротических тканей.

      2.3.4.2.Протеолитические ферменты и их ингибиторы.43 2.3.4.2.1. Матриксные металлопротеиназы. .43 2.3.4.2.2.Ингибиторы протеолитических ферментов.43 2.3.5.Осложнения при глубоких ожогах.44 2.4.Использование протеолитических ферментов для деструкции некротических тканей.

      2.4.1 .Способы удаления слоя некротической ткани.

      2.4.2.Протеолитические ферменты, используемые в лечении поверхностных ран.

      2.4.2.1 .Параметры и критерии протеолитической терапии.46 2.4.2.2.Протеолитические ферменты, используемые в медицине для деструкции некротических тканей.

      2.4.2.2.1 .Сериновые протеиназы, не обладающие коллагенолитической активностью (трипсин, химотрипсин).

      2.4.2.2.2.Цистеиновые протеиназы, не обладающие коллагенолитической активностью (папайи, бромелаин).

      2.4.2.2.3.Бактериальные коллагеназы класса металлопротеиназ (коллагеназы Clostridium histolyticum).

      2.4.2.2.4.Нрахиурины — коллагенолитические сериновые протеиназы беспозвоночных.49 2.5.Регуляция протеолитической активности система кровообращения и ингибиторы 11ротеол ити 4 ес к и x ферментов.

      2.5.1 .Система кровообращения как регулятор процесса деструкции некротической ткани протеолитическими ферментами.51 2.6.Заключение.

      3.МАТЕРИ АЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАН ИЯ.

      3.1 .Используемые препараты протеоли тических ферментов.57 3. /. 1 .SDS-электрофорез в полиакриламидном геле.57 3.1.2.Определение ферментативной активности по цветным олигопептидным субстратам.

      3.1.3. Измерение протеолитической активности по отношению к нашивным белком ~ естественным субстратам.

      3.1.3.1 .Измерение фибринолитической активности.58 3.1.3.2.Измерение коллагенолитической активности по скорости деструкции фибрилл интерстициальных коллагенов.

      3.1.3.3.Тест на характерную коллагенолитическую активность брахиуринов.

      3.2.Инактивация протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.

      3.2.]. Инактивация протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.

      3.2.2.Определение ингибиторов, ответственных за инактивацию протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.60 3.2.3.Ингибирование протеиназ плазмой крови человека.61 3.2.4.Ингибирование протеиназ сывороткой крови кролика.61 3.2.5.Ингибирование протеолитических ферментов жидкой фракцией гомогенизата мышечной ткани.

      3.2.6.Получение плазмы крови человека, дефицитной по алъфа-2 антиплазмииу и альфа-2 макроглобулину.

      3.2.7.Получение плазмы крови человека, обедненной по ингибиторам-серпипам, а также альфа-2 макроглобулину.62 3.3.Деструкция матрикса различных тканей протеолитическими ферментами.

      3.3.1 .Количественное измерение кинетики протеолитической деструкции образцов мышечной ткани.

      3.3.2.Качественный тест на эффективность протеолитической деструкции различных структур внеклеточного матрикса мышечной ткани.

      3.3.3.Качественный тест на эффективность протеолитической деструкции различных структур внеклеточного матрикса подкожной соединительной и. кожной (дермы и эпидермиса) тканей.

      4.РЕЗУЛБТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

      4.1 .Характеристика основных свойств выделенной фракции протеолитических ферментов — брахиуринов.

      4.2.Инактивация ферментов — сериновых протеиназ при взаимодействии с плазмой крови человека.

      4.3.г1рогеолитичес'кая деструкция образцов скани.

      4.3.1 .Кинетика протеолитической деструкции мышечных тканей с учетом диффузионных ограничений.

      4.3.2.Качественный анализ действия протеолитических ферментов на ткани гетерогенной структуры.

      5.ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ.

      5.1.Введение.

      5.2.математическая модель.

      5.2.1.Качественное описание модели:. 73 5.2.2.Постулаты модели:. 74 5.2.3.Параметры модели.76 5.3.Результаты модели.

      5.3.1 .Временная иерархия процессов.

      5.3.2.С'тационарное диффузионное распределение фермента.80 5.3.3.С'тационарное диффузионно-фильтрационное распределение фермента и ингибитора.

      5.3.4.Характерное время установления стационарного распределения.86 5.3.5.Кинетика протеолитической деструкции слоя пораженной ткани.88 5.4.Приложения.92 5.4.1. Приложен не I. 92 5.4.2.Приложение 2.

      6.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

      6.1.Роль ингибиторов протеолитических ферментов.

      6.2.Деструкция слоя некротической ткани неравномерной толщины с помощью протеолитических ферментовса.,.

      7.ВЫВОДЫ.

Моделирование процессов переноса белковых молекул при протеолитической деструкции матрикса тканей с подавленным кровообращением (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Проблема лечения некротического поражения тканей (в частности, некроза подкожных тканей при глубоких ожогах) очень актуальна в настоящее время. В пораженных тканях прекращается циркуляция крови и лимфывследствие чего массообмен (перенос молекул) в области некроза многократно замедляется. Некротические ткани представляют собой опасность как источник токсичных продуктов некроза и патогенных анаэробных бактерий, поэтому их удаление является необходимой стадией лечения ожога. Одним из методов очистки раны от некротических тканей является воздействие на нее протеолитическими ферментами, которые разрушают внеклеточный матрикс, обеспечивающий прочность ткани.

Необходимым условием жизнеспособности тканей является интенсивный массообмен: транспорт молекул-метаболитов должен происходить достаточно быстро для обеспечения жизнедеятельности клеток. Существует два механизма переноса молекул в тканях: диффузия и фильтрация (направленное перемещение, вызванное перепадом давления) — причем скорость этих процессов зависит от среднего расстояния между кровеносными капиллярами и проницаемости межклеточного пространства ткани. В здоровых тканях с нормальной системой микроциркуляции крови скорость диффузии и фильтрации достаточно велика для жизнеобеспечения клеток. При глубоком некрозе происходит изоляция пораженной области, поэтому процесс перемещения молекул между областью поражения и нормальными тканями многократно замедляется. Чем больше глубина некротического поражения, тем медленнее будет происходить диффузионный и фильтрационный перенос молекул вглубь пораженной области.

При обработке поверхности слоя некротической ткани (с подавленным кровообращением) раствором протеолитического фермента скорость деструкции матрикса пораженных тканей зависит от глубины проникновения фермента. Процесс проникновения фермента вглубь слоя некротической ткани ограничивается скоростью его диффузии в ткани и интенсивностью встречного потока экссудативной жидкости.

Понимание влияния процессов переноса на распределение молекул в тканях с подавленным кровообращением важно для эффективного решения таких проблем, как лечение глубоких ожогов путем деструкции матрикса некротических тканей протеолитическими ферментами.

2 Обзор Литературы.

7 Выводы.

1. Экспериментально показано на модели протеолитического разрушения образцов подкожной соединительной и мышечной ткани, что:

— сериновые протеиназы трипсин и химотрипсин разрушают основную массу белков, но оставляют неповрежденным каркас соединительной ткани.

— напротив, ферменты брахиурины, обладающие коллагенолитической активностью, полностью разрушают кожную и подкожную соединительную и мышечную ткани.

2. Экспериментально обнаружено, что и трипсин, и химотрипсин, и брахиурины концентрацией менее 40 мкМ полностью инактивируются при контакте с плазмой крови человека, причем более 90% ингибиторной активности обеспечивается альфа-1 антитрипсином.

3. Исследована теоретическая модель процесса проникновения фермента вглубь пораженной ткани, учитывающая диффузию, фильтрацию, а также инактивацию фермента находящимся в ткани ингибитором. Квазистационарное распределение фермента в слое пораженной ткани устанавливается в течение 2 часов и затем сохраняется при поддержании постоянной концентрации фермента снаружи.

4. Теоретически показано, что активность фермента сохраняется лишь в поверхностной части слоя пораженной ткани, тогда как в глубинном слое она полностью подавляется ингибитором. Отношение толщины слоя, содержащего активный фермент, к толщине некротического слоя, недоступного для ферментативной активности, равно отношению концентрации наносимого фермента к концентрации ингибитора, содержащегося в ткани.

5. Теоретически показано, что разрушение некротического слоя соединительной ткани происходит с экспоненциальным убыванием скорости по мере уменьшения толщины остающейся части пораженного слоя. Получена зависимость характерного времени экспоненциального затухания от концентрации наносимого фермента.

8 СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1) A.S. Khalili (Domogatskaya). A mathematical approach to enzyme treatment of burn wounds. // Тезисы международной конференции «Biocatalysis 2002» (Москва) — 2002.

2) A.C. Халили (Домогатская). Ограничение активности протеолитического фермента, используемого для лечения ожоговых ран, потоком экссудата интерстициальной жидкости. // Тезисы конференции «III Съезд Российского Биохимического Общества» — 2002.

3) A.C. Халили (Домогатская). С.II. Домогатский, О. Г1. Близнюков, Э. К. Рууге. Обработка протеиназами поверхности ожоговых ран: математическое описание распределения фермента. // Биофизика, т. 48. вып. ], стр. 76−83.

4) A.C. Халили (Домогатская). С. П. Домогатский, Э. К. Рууге. Ограничение активнос ти протеолитического фермента, используемого для лечения ожоговых ран, потоком специфического ингибитора, содержащегося в экссудате. // Вестник МГУ (Химия), т. 44. вып. 1. стр. 3 1 -35.

5) A.C. Домогатская, С. П. Домогатский, Э. К. Рууге. Обработка протеиназами поверхности ожоговых ран: математическое описание кинетики лизиса. // Биофизика, 48 (в печати).

2.6 Заключение.

Целью данной работы было изучение влияния процессов переноса белковых макромолекул (протеолитических ферментов и ингибиторов) на процесс протеолитической деструкции тканей с подавленным кровообращением.

Для этого необходимо было решить следующие практические задачи:

1. Исследовать экспериментально взаимодействие ферментов — сериновых протеиназ (трипсин, химотрипсин, брахиурины семейства 81 А) — с ингибиторами плазмы крови человека;

2. Исследовать экспериментально роль коллагенолитической активности на процесс деструкции различный структур матрикса тканей гетерогенной структуры (мышечной, подкожной соединительной, дермы и эпидермиса);

3. Описать процесс деструкции ткани с подавленным кровообращением раствором протеолитического фермента, нанесенного на ее поверхность, с помощью математической модели, учитывающей влияние следующих факторов:

— процессов переноса (диффузии и фильтрации),.

— инактивации фермента при взаимодействии с ингибиторами,.

— изменение глубины слоя пораженной ткани вследствие ее протеолитической деструкции;

4. Получить распределение активного фермента в слое пораженной ткани, оценить глубину его проникновения и скорость его инактивации (теоретически);

5. Установить зависимость скорости деструкции слоя пораженной ткани с подавленным кровообращением протеолитическими ферментами от их распределения в ткани (теоретически).

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Используемые препараты протеолитических ферментов.

В работе использовались высокоочищенные (не менее 95% чистоты) препараты ферментов — сериновых протеиназ: трипсин (Sigma), химотрипсин (Sigma) и брахиурины семейства SI A (Imtek). Специфическая ферментативная активность препаратов составляла не менее 85% от максимально возможной и определялась следующим образом:

• трипсиноподобная, химотрипсиноподобная и плазминоген-активирующая активности определялись по скорости расщепления олигопептидных паранитроанилидных субстратов (Bz-Arg-pNA, Glp-Ala-Ala-Leu-pNA и Val-Leu-Lys-pNA, соответственно);

• фибринолитическая активность определялась методом лизиса фибриновых пленок;

• коллагенолитическая активность определялась количественно (по скорости лизиса нерастворимого фибриллярного коллагена 1,111 типов).

• качественный тест на специфическую коллагенолагенолитическую активность проводился путем анализа продуктов протеолитической деградации растворимого коллагена I типа методом SDS-электрофореза в 7% геле. Тест показал характерное для ферментов-брахиуринов расщепление нативной молекулы коллагена I в соотношении 1:3.

3.1.1 SDS-электрофорез в полиакриламидном геле.

Белковый состав ферментных препаратов был характеризован методом SDS-электрофореза (методика Laemmly). Препарат концентрацией 3 мг/мл, прокипяченный в течении 5 минут в восстанавливающем и в невосстанавливающем Sample-буфере (по Laemmly), наносился в количестве 2 мкл в лунки концентрирующего полиакриламидного геля (6%, рН6.8). Электрофорез проводился в установке Biorad при значении тока 40 мА и значении напряжения 100 V. Передний фронт проходил концентрирующий и разделяющий (12%, рН8.8) гели за 40 минут. После электрофореза гели фиксировались в растворе спирт-перхлорная кислота 10 минут, прокрашивались раствором Coomasie Brilliant Blue в перхлорной кислоте 1 час и отмывались водой в течении 4 часов.

3.1.2 Определение Ферментативной активности по цветным олигопептидным субстратам.

Специфическая субстратная активность ферментных препаратов измерялась следующим образом:

Трипсиноподобная активность ферментных препаратов измерялась по скорости расщепления цветного паранитроанилидного олигопептидного субстрата Bz-Arg-pNA (Serva). В пластиковой кювете приготовлялся 50 мкМ раствор субстрата в натрий-фосфатном буфере (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ натрий хлора, 3 мМ азида натрия, рН7.5). содержащий 2% диметилформамида. В кювету добавлялся раствор фермента: 50 мкл на 1 мл реакционной смеси, кювета помещалась в спектрофотометр (Spectronic 3000). где снималась кинетика расщепления субстрата на длине волны 405 нм в течение одной минуты. Скорость расщепления субстрата определялась по наклону линейной части кинетической кривой.

Химотрипсиноподобная активность ферментных препаратов измерялась по скорости расщепления цветного паранитроанилидного субстрата Glp-Ala-Ala-Leu-pNA (Serva) аналогичным образом.

Плазминоподобнан активность ферментных препаратов (способность активировать плазминоген профермент плазмина) измерялась по скорости расщепления цветного паранитроанилидного субстрата Val-Leu-Lys-pNA (Serva) аналогичным образом.

3.1.3 Измерение протеолитической активности по отношению к нативным белкам — естественным субстратам.

3.1.3.1 Измерение фибринолитической активности.

Измерение фибринолитической активности ферментных препаратов производилось по скорости лизиса фибриновых пленок (метод «fibrin plate», [11]). Для этого 12 мл раствора фибриногена концентрацией 7 мг/мл смешивали с 1 мл раствора тромбина концентрацией 1 мг/мл и полимеризовали пластиной размером 8 см х 12 см, толщиной около 1 мм. Раствор ферментов концентрацией 1 мг/мл наносили каплями по 20 мкл на поверхность застывшего полимера фибрина. Измеряли зависимость радиуса зон лизиса от времени.

3.1.3.2 Измерение коллагенолитической активности по скорости деструкции фибрилл интерстициальных коллагенов.

Лиофилизованный фибриллярный коллаген I, III типа смешивали с Tris-буфером до получения равномерной взвеси с содержанием коллагена 5 мг/мл. К 1.5 мл взвеси добавляли препарат протеолитического фермента так, что его содержание составляло 5 мг/мл. Эксперимент проводился при комнатной температуре, при постоянном перемешивании. Через 5 часов пробирка подвергалась центрифугированию, жидкость удалялась. После повторного центрифугирования и удаления жидкости пробирка взвешивалась. Остаточный вес неразрушенных коллагеновых фибрилл (разница в весе пробирки после и до эксперимента) сравнивался с остаточным весом коллагеновых фибрилл в контрольной пробирке, в которую добавлялся буфер, не содержащий фермента.

3.1.3.3 Тест на характерную коллагенолитическую активность брахиуринов.

Характерная особенность брахиуринов расщеплять молекулу нативного коллагена на две части соотношением размеров 1:3 контролировалась согласно методике [132]. Раствор нативного коллагена человека типа I концентрацией 3 мг/мл инкубировался с коллагенолитическим препаратом концентрацией 1 мг/мл в течении 1 часа (в буфере, содержащем 50 мМ TrisHCl, ЗЮО мМ NaCl, 20 мМ СаС12, 25 мМ ацетата, pH 7.5). Реакционная смесь кипятилась в течении 5 минут в восстанавливающем Sample-буфере (по Laemmly) — при этом останавливалась реакция. Состав реакционной смеси был характеризован методом SDS-электрофореза (согласно Laemmly). Смесь наносилась в количестве 7 мкл в лунки концентрирующего полиакриламидного геля (4%, рН6.8). Электрофорез проводился при значении тока 40 мА и значении напряжения 100 V. Передний фронт проходил концентрирующий и разделяющий (7%, рН8.8) гели за 30 минут. После электрофореза гели обрабатавались, как описано выше.

3.2 Инактивация протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.

3.2.1 Инактивация протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.

Для исследования взаимодействия ферментных препаратов с плазмой крови человека проводились на плазме, стабилизированной цитратом натрия (13 мМ), объединенной в пул и хранимой в аликвотах при -70° С. Ингибирующее действие плазмы определялось по остаточной активности ферментативной активности, которая измерялась по скорости расщепления олигопептидных субстратов.

3.2.2 Определение ингибиторов, ответственных за инактивацию протеолитических ферментов при контакте с плазмой крови человека.

Ингибиторы ферментов — сериновых протеиназ трипсина, химотрипсина и брахиуринов определялись путем аффинной хроматографии плазмы крови человека на сорбенте с иммобилизованным ферментным препаратом. Для изготовления сорбента носитель — бромциан-активированную сефарозу — после предварительного набухания в слабоконцентрированной соляной кислоте (концентрация 1 мМ, рН 3.0) инкубировали в течение 5 минут с раствором протеоли гичсского фермента концентрацией 2 мг/мл. Затем сорбент промывался и фиксировался в лечении 2 часов в одномолярном растворе глицина, после чего промывался буфером с содержанием 0.02% азида натрия. Процедура иммобилизации проводилась при комнатной температуре. Контроль за сохранением нативности ферментов после процедуры иммобилизации производился путем измерения их протеолитической активности добавлением олигопептидного паранитроанилидного субстрата к готовому сорбенту.

Для определения ингибиторов плазмы крови человека, ответственных за инактивацию протеолитической активности, плазма пропускалась через сорбент с иммобилизованным ферментным препаратом. Белки, связавшиеся с иммобилизованным ферментом, были элюированы раствором ацетата, рН 2.5. Их состав определялся методом 8138-электрофореза в 7% и 12% гелях. Отсутствие ингибиторов в плазме, пропущенной через сорбент, контролировалось измерением ее ингибирующей способности по методу, описанному выше.

3.2.3 Ингибирование протеиназ плазмой крови человека.

Ингибирование производилось плазмой крови человека (содержала цитрат натрия для подавления коагуляционной активности, до эксперимента хранилась при температуре -80°С). Раствор брахиуринов концентрацией 10 мг/мл разбавлялась плазмой до требуемой концентрации (плазма разбавлялась не более, чем на 10%). Через определенные промежутки времени измерялась ферментативная активность смеси по цветным субстратам Вг-А^-рЫА и 01р-А1а-А1а-Ьеи-рЫА. Начальная активность, соответствующая 1=0, измерялась для смеси протеиназ соответствующей концентрации без добавления плазмы. Реакция производилась при температуре 25 °C, рН7.4.

3.2.4 Ингибирование протеиназ сывороткой крови кролика.

Работа проводилась на сыворотке, выделенной из крови кролика, которая после коагуляции подвергалась центрифугированию (10 000об/мин, 1−14 (Весктап), 15 мин). Кинетика ингибирования снималась аналогично опытам по ингибированию, проведенным на плазме человека. Ферментативная активность измерялась по цветному субстрату Вг-А^-рКА. Реакция производилась при температуре 25 °C, рН7.4−7.7.

3.2.5 Ингибирование протеолитических ферментов жидкой фракцией гомогенизата мышечной ткани.

Мышечная ткань человека (без консервантов, до эксперимента находилась в замороженном на -20°С состоянии) измельчалась до размера нескольких миллиметров, после чего в ручном гомогенизаторе был получен гомогенат ткани, который был отцентрифугирован в течении 10 мин при ускорении 10 000§. В полученный супернатант добавлялся азид натрия до концентрации 0.02% для подавления бактериального роста, а на следующий день подвергался повторному центрифугированию при тех же условиях, в результате чего был получен прозрачный супернатант — жидкая фракция гомогената мышечной ткани человека. Измерение способности данной фракции ингибировать протеолитическую активность ферментов проводились аналогично опытам с плазмой человека. Ферментативную активность измеряли по цветному субстрату Вг-А^-рКА. Опыты проводились при температуре 25 °C, рН7.5.

3.2.6 Получение плазмы крови человека, дефицитной по альфа-2 антиплазмину и альфа-2 макроглобулину.

Предобработка плазмы крови урокиназой производилась следующим образом: к 1 мл плазмы крови человека добавлялось 10 мкл раствора урокиназы активностью 10 ООО ед/мл. Дополнительно добавлялся азид натрия до 0.02%. Смесь инкубировалась 2 часа при температуре 37 °C (в термостате New Brunswick G-24). Это время является достаточным для активации всего плазминогена в реакционной смеси (2.5 мкМ). Плазмин должен был связать весь альфа2-антиплазмин (0.9 мкМ) за секунды (характерное время реакции: миллисекунды). Наличие активного плазмина в плазме контролировалось по цветному субстрату Val-Leu-Lys-pNA, активность равнялась 2/5 мкМ/мин (плазма, неактивированная урокиназой имеет нулевую активность по этому субстрату).

3.2.7 Получение плазмы крови человека, обедненной по ингибиторам-серпинам, а также альфа-2 макроглобулину.

Предобработка плазмы крови трипсином производилась следующим образом: к 1 мл плазмы крови человека добавлялось 4 мг трипсина. Дополнительно добавлялся азид натрия до 0.02%. Смесь инкубировалась 3 часа при температуре 37 °C (в термостате New Brunswick. G-24). Наличие активного трипсина в плазме контролировалось по цветному субстрату Bz-Arg-pNA. активность равнялась 3 мкМ/мин (плазма, не предобработанная трипсином, имеет нулевую активность по этому субстрату).

3.3 Деструкция матрикса различных тканей протеолитическими ферментами.

3.3.1 Количественное измерение кинетики протеолитической деструкции образцов мышечной ткани.

Эксперимент проводился на образцах мышечной ткани человека и быка, по методике аналогичной описанной в работе [105]. Кинетика лизиса ткани определялась по скорости изменения массы образца мышечной ткани (бычьей или человеческой) массой 150 мг и диаметром 5−6 мм, помещенного в герметично закрывающуюся пробирку, содержащую раствор фермента (трипсина, химотрипсина или брахиурипов) концентрацией 10 мг/мл. Образцы инкубировались в растворе фермента при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для измерения остаточной массы образцов ткани, излишняя жидкость экстрагировалась путем центрифугирования в течении 10 минут со скоростью 10 000 об/мин. Ферментативная активность раствора в течение эксперимента поддерживалась постоянной.

3.3.2 Качественный тест на эффективность протеолитической деструкции различных структур внеклеточного матрикса мышечной ткани.

Для оценки действия ферментных препаратов на отдельные структурные компоненты гетерогенных тканей, обеспечивающие их механическую прочность, был разработан следующий метод качественного анализа:

Для эксперимента были использованы поперечные срезы мышечной ткани (скелетной мускулатуры) человека и быка толщиной 100 мкм, полученные с помощью криотомного ножа. Толщина образца, с одной стороны, была достаточной, чтобы сохранить механическую прочность ткани, с другой стороны, достаточно малой, чтобы исключить влияние диффузионных ограничений на ход эксперимента. Наблюдение за состоянием ткани велось с методом световой микроскопии при увеличении х 20 — 50.

Образцы тканей подвергались воздействию протеолитических ферментов.

А) Трипсина, химотрипсина, обладающих общей протеолитической неколлагенолитической активностью.

Б) Брахиуринов, обладающих комплексной активностью (коллагенолитической и протеолитической).

Срезы мышечной ткани помещались в лунки 24-луночного планшета ЬтЬго, содержащие раствор ферментов различной концентрации.

Концентрация ферментов варьировалась в диапазоне 0.1 — 10.0 мг/мл, активность ферментов поддерживалась постоянной, эксперимент проходил при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

Состояние структур внеклеточного матрикса мышечной ткани оценивалось по следующим критериям:

1. Светорассеяние — характеризует целостность неколлагеновых белков;

2. Целостность интерстициального внеклеточного матрикса, включающего фибриллы коллагенов I и III типа (перимизий);

3. Целостность базальных мембран (входящих в состав оболочки мышечных волокон), включающих полимер коллагена IV типа (эндомизий);

4. Прочность (упругость) образца ткани.

3.3.3 Качественный тест на эффективность протеолитической деструкции различных структур внеклеточного матрикса подкожной соединительной и кожной (дермы и эпидермиса) тканей.

Для оценки действия ферментных препаратов на отдельные структурные компоненты кожной (дермы, эпидермиса) и подкожной соединительной тканей, обеспечивающие их механическую прочность, был разработан следующий метод качественного анализа:

Для эксперимента были использованы тонкие срезы кожной ткани крысы, (включающие в себя эпидермис, дерму, подкожную соединительную и мышечную гкани) толщиной 30 мкм, полученные с помощью криотомного ножа. Толщина образца, с одной стороны, была достаточной, чтобы сохранить механическую прочность ткани, с другой стороны, достаточно малой, чтобы исключить влияние диффузионных ограничений на ход эксперимента. Наблюдение за состоянием ткани велось с методом фазово-контрастной микроскопии (был использован микроскоп Zeiss со встроеной видеокамерой) при увеличении х 50−100.

Срезы мышечной ткани помещались в лунки 24-луночного планшета Linbro, содержащие раствор ферментов различной концентрации.

Целостность структур матрикса кожной и подкожной соединительной ткани оценивалось по аналогичным критериям, как в случае мышечной ткани.

4 Результаты экспериментального исследования.

4.1 Характеристика основных свойств выделенной фракции протеолитических ферментов — брахиуринов.

Были определены основные свойства комплекса ферментов брахиуринов (Imlek):

1) Из результатов SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 4) можно определить молекулярные массы ферментов, входящих в состав полученного комплекса протеиназ. Они равняются приблизительно 29 и 36 кДа.

2) Смесь протеиназ PC полностью сохраняла ферментативную активность в течение 3 дней при температуре 25 °C и в течение двух недель при 4 °C.

3) Из результатов SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 5) можно определить характерную особенность коллагенолитических ферментов PC расщеплять молекулу коллагена в соотношении 1:3. Полученные фрагменты молекулы коллагена после этого расщепляются прочими ферментами PC до состояния пептидов.

Рисунок 4. Анализ белкового состава Рисунок 5. Определение характерной комплексного препарата протеолитических для брахиуринов коллагенолитической ферментов брахиуринов методом SDSактивности по отношению к молекулярному электрофореза: коллагену человека I типа методом SDS.

1) LMW (Референс молекулярных электрофореза. весов) 1) Нативный молекулярный коллаген.

2) препарат брахиуринов — не человека (тип I, III) восстовленный. 2) Нативный молекулярный коллаген.

3) препарат брахиуринов человека (тип I, III), расщепленный восстановленный меркаптоэтанолом ферментами брахиуринами на две составные части (25% и 75%).

Ref EZ EZ LMW ox red С-1 С-1 +ТР +EZ.

9 43 kDa? Bp 100 kDa Collagen ф Alpha-chain.

30 kDa fH A" 75 kDa.

20 kDa ~ ;

14 kDa «я» Low mol. Weight degradation ptOdUCtS.

4.2 Инактивации ферментов — сериновых протеиназ при взаимодействии с плазмой крови человека.

Было получено, что плазма крови человека при добавлении к раствору ферментовбрахиуринов, а также трипсина и химотрипсина, подавляет их ферментативную активность (трипсиноподобную, химотрипсиноподобную) менее, чем за 0.5 минут. Ингибиторная способность плазмы крови человека равняется 20 мкМ, что соответствует полному ингибированию раствора трипсина концентрацией 0.8 мг/мл.

Анализ элюата, полученного пропусканием плазмы крови человека через аффинный сорбент, несущий в качестве лиганда один из ферментных препаратов, показал, что 90% белков, связавшихся с ферментами, имеют молекулярную массу в 5055 кДа (см. рис.6). Полученые данные указывают, что ингибиторная активность плазмы крови человека на 90% обусловлена активностью альфа-1 антитрипсина (альфа-1 ингибитора протеиназ).

Рисунок 6. Анализ белков плазмы крови, связывающихся с ферментами-брахиуринами (ингибиторов протеолитических ферментов — серпиновых протеиназ) методом 81)8- шектрофореза.

1) Референс 55 кДа.

2) Элюат ингибиторов из плазмы крови человека, связавшихся с иммобилизованными брахиуринами.

3) Элюат инг ибиторов из плазмы крови человека, связавшихся с иммобилизованным бычьим трипсином.

50 — 55 кДа а! -антитрипсин).

4.3 Протеолитическая деструкция образцов ткани.

4.3.1 Кинетика протеолитической деструкции мышечных тканей с учетом диффузионных ограничений.

Измерение кинетики протеолитической деструкции тканей с учетом диффузионных ограничений.

При воздействии на образцы мышечной ткани растворами ферментов:

• общей протеолитической (неколлагенолитической активноститрипсина, химотрипсина,.

• комплексной активности (коллагенолитической и протеолитической) -брахиуринов. были получены следующие результаты (см. рисунок 7 и таблицу 20):

Показать весь текст

Список литературы

  1. A.A., Глянцев С. П., Сахаров Ю. И., Саввина Т. В. Морфологическая оценка воздействия коллагеназы камчатского краба paralithodes camtschatica на раневой процесс в эксперименте. Бюлл.эксп.биол.мед. 1992. 114(12), 660−663.
  2. И.Г., Быков B.JI., Волкова О. В. и др. Руководство по гистологии. 1,2. 2001. «СПб, «СпецЛит».
  3. ., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, изд. 2. 2. 1994. «М., «Мир».
  4. A.A. и др. Взаимодействие ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным на диальдегидцеллюлозе протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба. Вестник МГУ (Химия). 2003. 44(1), в печати.
  5. С.Д., Гуревич К. Г. Биокинетика (Практический курс).. 1999. «М., «Фаир-Пресс».
  6. .С., Бурмистров В. М. под ред. Ожоги.. 1981. «Ленинград, «Медицина».
  7. С.П., Саввина Т. В., Заец Т. Л. Сравнительное изучение активности протеолитических ферментов, применяемых в хирургии для очищения гнойных ран. Бюлл. Эксп. Мед. Биол. 1996. 121(6), 716−720.
  8. В.М. Теория фильтрации. Соросовский Образовательный Журнал. ?998. 2, 121−128.
  9. Климова, Ведищева, Стронгин. Выделение и характеристика коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса краба-стригуна Chionoetes opilio. Докл. Акад. Наук СССР. 1991. 317(2), 482−484.
  10. A.B., Руденская Г. Н., Богачева A.M., Воюшина Т. Л., Степанов В. М. Аффинные сорбенты для выделения протеиназ, содержащие в качестве лигандов морфолиды трипептидов. Биохимия. 1997. 23(11), 868−876.
  11. Л.В., Карабасова М. А. и др. Действие протеолитического препарата морикразы на состояние рубцовой ткани в условиях in vitro. Вопр. Мед. Химии. 1998. 44(3).
  12. М.Ю. Распределение введенных в кровоток белковых препаратоув при артериальной тромботической окклюзии. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1999.
  13. О.Г., Арефьева Т. И. Роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в инвазии злокачественных опухолей. Биохимия. 1994. 59(3), 340−352.
  14. С.А., Карелин A.A. Принципы биохимической диагностики раневого инфекционного процесса. 1998. 46−51.
  15. Г. Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. Том 1. 2002. «Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика».
  16. А.Б. Биофизика. 1,2. 1999. «М., «Книжный дом «Университет».
  17. Г. Н., Купенко О. Г., Исаев В. А., Степанов В. М., Дунаевский Я. Е. Выделение и свойства карбоксипептидазы камчатского краба Paralithodes camchatica. Биоорг. Химия. 1995. 21(4), 249−255.
  18. Г. Н., Исаев В. А., Степанов В. М. и др. Выделение трипсина PC камчатского краба Paralithodes camtschatica и его свойства. Биооргаиическая Химия. 1998. 24(2), 112−118.
  19. Сандахчиев, Ставский и др. Экспериментальное изучение лечебных свойств и токсичности мази, содержащей коллагеназу камчатского краба. «Вестник РАМН». 1998. 4, 50−55.
  20. Д.В. Направленная доставка ферментов как способ локального воздействия на компоненты сосудистой стенки. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1987. .
  21. И.Ю., Глянцев С. П., Литвин Ф. Е., Гордеев В. Ф. Фармакокинетическое изучение коллагеназы камчатского краба Paralithodes Camtschatica. Вопр. Мед. Химии. 1994. 40(3), 18−20.
  22. И.Ю., Шехонин Б. В., Глянцев С. П., Литвин Ф. Е. Иммуногистохимическое изучение гнойных ран у крыс после аппликации коллагеназы краба paralithodes camtschatica. Бюлл. экспер.биол.мед. 1993. 116 (9), 267−270.
  23. Сахаров, Джунковская. Эластаза из гепатопанкреаса камчатского краба. Биохимия. 1993. 58(9), 1445−1452.
  24. Сахаров, Матвеев, Домогатский. Связывание афинного лиганда с объемной мишенью. Роль диффузионных ограничений. Биофизика. 1991. 36(1), 49−54.
  25. Н.И. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции. Биоорганическая Химия. 1998. 24(4), 245−255.
  26. Н.И. Коллагеназы различного происхождения и их роль в деструкции коллагена в норме и патологии. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук.
  27. Я. Аффинная хроматография. 1980. «М., «Мир».
  28. Фрайфелдер Д, Физическая биохимия.. 1980. «М., «Мир».
  29. .Б., Фукс Б. И. Очерки морфологии и гистохимии соединительной ткани.. 1968. «Л., «Медицина».
  30. Хэм А., Кормак Д. Гистология. 1−5. 1982. «М., «Мир».
  31. Р., Тевс Г. (под. ред.). Физиология человека. 2. 1996. «М., «Мир».
  32. Г. А. и др. Определение активности альфа-1 антитрипсина и альфа-2 макроглобулина в плазме крови человека унифицированным энзиматическим методом. Методы Клинической Биохимии. 1982. 22−26.
  33. Adam С., Bieth J.G. Inhibition of neutrophil elastase by the alpha-1 proteinase inhibitor immunoglobulin A complex. FEBSLett. 1996. 385(3), 201−204.
  34. Agren M. Matrix metallloproteinases (MMPs) are required for re-epitalization of cutaneous wounds. Arch. Dermatol. Res. 1999. 291, 583−590.
  35. Agren M.S. et.al. Topical synthetic inhibitor of matrix metalloproteinases delays epidermal regeneration of human wounds. Exp. Dermatol. 2001. 10, 337−348.
  36. Alitalo, Vaheri. Pericellular matrix in malignant transformation. Advances in cancer research. 1982. 37, 111−158.
  37. Anand S., Diamond S.L. Computer simulation of systemic circulation and clot lysis dynamics during thrombolytic therapy that accounts for inner clot transport and reaction. Circulation. 1996. 94, 763−774.
  38. Anderson J.L. et.al. Particle diffusion as a function of concentration and ionic strength. J. Phys. Chem. 1978. 82, 608−616.
  39. Ashcroft G.S. et.al. Age-related differences in the temporal and spatial regulation of matrix metalloprotainases (MMPs) in normal skin and acute cutaneorus wounds of healthy humans. Cell Tissue Res. 1997. 290, 581−591.
  40. Aumaillay M., Gayraud B. Structure and biological activity of the extracellular matrix. J. Mol. Med. 1998. 76, 253−265.
  41. Barisoni D. et.al. Monitoring of elestase in plasma of burned patients in relation to other inflammation parameters. Sums. 1991. 17(2), 141−146.
  42. Berndt A. et.al. Dreidimensionales in-vitro-Invasionsmodell fuer orale Plattenepithelkarzinome. Mund Kiefer GesichtsChir. 1998. 2, 256−260.
  43. Blom A.M. et. al, Structural characterisation of inter-alpha-inhibitor. J. Biol. Chem. 1999. 274(1), 298−304.
  44. Bode W. et.al. Structural properties of matrix metalloproteinases. Cell. Mol. Life Sci. 1999. 55, 639−652.
  45. Boderke P. et.al. Modeling of diffusion and concurrent metabolism in cutaneous tissue./. Theor. Biol. 2000. 204, 393−407.
  46. Borkakoti N. Structural studies of matrix metalloproteinases. J.Mol.Med. 2000. 78, 261−268.
  47. Brinkman H.C. A calculation of the viscous force exerted by a flowing fluid on a dense swarm of particles. Appl. Sci. Res. Al. 1947. 27−34.
  48. Castagnoli C. et.al. Role of T-lymphocytes and cytokines in post-burn hypertrophic scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 107−108.
  49. Chary S.R., Jain R.K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. 86, 5385−5389.
  50. Clubb B.H., Shivers R.R. Extracellular matrix regulates microfilament and vinculin organization in C6-glioma cells. Acta Neuropathol. 1996. 91, 31−40.
  51. Coulomb B., Dubertret L. Skin cell culture and wound healing. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 109−112.
  52. Crago A.M., Koronakis V. Binding of extracellular matrix laminin to Escherichia coli expressing the Salmonella outer membrane proteins Rck and PagC. FEMS Microbiology Lett. 1999. 176,495−501.
  53. Cremer M.A., Rosloniec E.F. The cartilage collagens: a review of their structure, organization and role in the pathogenesis of experimental arthritis in animals and in human rheumatic disease. J. Mol. Med. 1998. 76, 275−288.
  54. Cullen B. et.al. The role of oxidised regenerated cellulose/collagen in chronic wound repair and its potential mechanism of action. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002. 34, 1544−1556.
  55. Davidson J.M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 1998. 290 (Suppl), 1−11.
  56. Dije M.Z., Stone S.R., Le Bonniec B.F. Intrinsic specificity of the reactive site loop of alpha-1 antitrypsin, alpha-1 antichymotripsin, antithrombin III and protease nexin I. J. Biol. Chan. 1997. 272(26), 16 268−16 273.
  57. Edy, De Cock, Collen. Inhibition of plasmin by normal and antiplasmin-depleted human plasma. Thromb. Res. 1976. 8(4), 513−518.
  58. Eldad A. et.al. Early nonsurgical removal of chemically injured tissue enhances wound healing in partial thickness burns. Burns. 1998. 24, 166−172.
  59. Fasman F. ed. Handbook of biochemistry and molecular biology. Vol. 2. 1977. CRC Press, Cleveland, Ohio.
  60. FDA Wound Healing Clinical Focus Group. Guidance for industry: chronic cutaneous ulcer and burn wounds developing products for treatment. Wound Rep. Regeneration. 2001. 9(4), 258−268.
  61. Flessner M.F., Lofthouse J., Zakaria E.R. In vivo diffusion of immunoglobulin F in muscle: effects of binding, solute exclusion and lymphatic removal. Am. J. Physiol. 1997. 273, 2783−2793.
  62. Folie B.J., Mclntire L.V. Mathematical analysis of mural thrombogenesis. Biophys. J. 1989. 56, 1121−1141.
  63. Foy B.D., Blake J. Diffusion of paramagnetically labeled proteins in cartilage: enhancement of the 1 -D NMR technique. J. ofMagn. Res. 2001. 148, 126−134.
  64. Friedrich R.E. et.al. Nachweis von extrazellulaerem Matrixprotein (Laminin) in experimentellen arteriellen Anastomosen. Mund Kiefer GesichtsChir. 1998. 2, 118−121.
  65. Fu X., Wang Z., Sheng Z. Advances in wound healing research in China: from antiquity to the present. Wound Rep. Reg. 2001. 9, 2−10.
  66. Giovannini U.M. Treatment of scars by steroin injections. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 116−117.
  67. Godfrey E. W., Gradall K.S. Basal lamina molecules are concentrated in myogenic regions of the mouse limb bud. Anat. Embryol. 1998. 198, 481−486.
  68. Gonzalez S. et.al. Non-invasive (real-time) imaging of histologic margin of a proliferative skin lesion in vivo. Int. Invest. Dermatol. 1998. 111(3), 538−539.
  69. Goodwin A.E., Pauli B.U. A new adhesion assay using buoyancy to remove nonadherent cells. J. Immunol. Meth. 1995. 187, 213−219.
  70. Grant A. Collagenolytic serine protease with trypsin-like specificity from the Fidller crab Uca pugilator. Biochemistry. 1983. 22, 354−358.
  71. Gullberg D., Tiger C.F., Veiling T. Laminins during muscle development and in muscular dystrophies. Cell. Mol. Life Sci. 1999. 56, 442−460.
  72. Harpel P.C. Alpha-2 plasmin inhibitor and alpha-2 macroglobulin plasmin complexes in plasma. J. Clin. Invest. 1981. 68, 46−55.
  73. Hay. Extracellular matrix. J. Cell Biol. 1981. 91(3), 205−223.
  74. Heiduschka P. et.al. Defined adhesion and growth on neurones on artificial structured substrates. FJectrochimica Acta. 2001. 47, 299−307.
  75. Hynes R.O. Fibronectins. Sci. Am. 1986. 254(6), 42−51.
  76. Irving J.A. et.al. Phylogeny of the Serpin superfamily: implications of patterns of amino acid conservation for structure and function. Gen. Res. 2000. 10, 1845−1864.
  77. Jain R.K., Gerlowski L.E. Extravascular transport in normal and tumor tissues. Cril. Rev. Oncol. Hematol. 1986. 5(2), 115−170.
  78. Johansson L., Lofroth J.E. Diffusion and interaction in gels and solutions. 4. Hard sphere Brownian dynamics simulations. J. Chem. Phys. 1993. 98, 7471−7478.
  79. Jones J.J., Cohen R.L., Chambers D.A. Collagen modulates gene activation of plasminogen activator system molecules. Exp. Cell Res. 2002. 280, 244−254.
  80. Jurgens K.D., Peters T., Gross G. Diffusivity of myoglobin in intact skeletal muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. 91, 3829−3833.
  81. Kam L. et.al. Axonal outgrowth of hippocampal neurons on micro-scale networks of polylysine-conjugated laminin. Biomaterials. 2001. 22, 1049−1054.
  82. Kim J.T., Andersom J.L. Diffusion and flow through polymer-lined micropores. Ind. Eng. Chem. Res. 1991. 29, 1008−1016.
  83. Klasen H.J. A review on the nonoperative removal of necrotic tissue from burn wounds. Burns. 2002. 26, 207−222.
  84. Kleinman, Klebe, Martin. Role of collagenous matrices in the adhesion and growth of cells (review). J. of Cell Biol. 1981. 88,473−485.
  85. Klimova et.al. The isolation and properties of collagcnolytic proteases from crab hepatopancreas. Biochem. Biophys. Research Comm. 1990. 166(3), 1411−1420.
  86. Kuznetsova et.al. Synthesis and application of sorbents for affinity chromatography of serine proteases. Chromatographici. 1997. 45, 44−48.
  87. Ladwig G.P. et.al. Ration of activated matrix metalloproteinase-9 to tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in wound fluids are inversely correlated with healing of pressure ulcers. Wound Rep. Reg. 2002. 10, 26−37.
  88. Laskowski M., Kato I. Protein inhibitors of proteinases. Ann. Rev. Biochem. 1980. 49, 593−626.
  89. Latijnhouwers M.A.H.E. et.al. Tenascin-C degradation in chronic wounds is dependent on serine proteinase activity. Arch. Dermatol. Res. 1998. 290, 490−496.
  90. Liekens S., De Clercq E., Neyts J. Angiogenesis: regulators and clinical applications. Biochem. Pharmacol. 2001. 61, 253−270.
  91. LorenaD. et.al. Normal scarring: importance of myofibroblasts. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 86−92.
  92. Luckenbill-Edds L. Laminin and the mechanism of neuronal outgrowth. Brain Res. Rev. 1997. 23,1−27.
  93. Ludeman J.P. et.al. Structure of a Serpin-enzyme complex probed by cysteine substitutions and fluorescense spectroscopy. Biophys. J. 2001. 80, 491−497.
  94. Mackarel A.J. et.al. Migration of neutrophils across human pulmonary endothelial cells is not blocked by matrix metalloproteinase or serine protease inhibitors. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1999. 20,1209−1219.
  95. Marchina E., Barlati S. Degradation of human plasma and extracellular matrix fibronectin by tissue type plasminogen activator and urokinase. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1996. 28(10), 1141−1150.
  96. Martin G.M., Timpl R., Kuhn K. Basement Membrane Proteins: Molecular Structure and Function. Adv. in Prot. Chem. 1988. 39, 1−50.
  97. Matveyev M.J., Domogatsky S.P. Penetration of macromolecules into contracted blood clot. Biophys.J. 1992. 63, 862−863.
  98. Maurer H.R. Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use. Cell. Mol. Life Sci. 2001. 58, 1234−1245.
  99. Mayne, Sanderson. The extracellular matrix of sceletal muscle. Collagen Rel.Res. 1985. 5, 449−468.
  100. Mazar A.P., Henkin J., Goldfarb R.H. The urokinase plasminogen activator system in cancer: implications for tumor angiogenesis and metastasis. Angiogenesis. 1999. 3, 15−32.
  101. Meaume S. Chronic wound scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 103−106.
  102. Meek M.F. Evaluation of several techniques to modify denatured muscle tissue to obtain a scaffold for peripheral nerve regeneration. Biomaterials. 1999. 20, 401−408.
  103. Mekkes J.R. et.al. In vitro tissue-digesting properties of krill enzymes compared with fibrolysin/DNAse, papain and placebo. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. 29(4), 703−706.
  104. Mekkes J.R., Zeegelaar J.E., Westerhof W. Quantitative and objective evaluation of wound debriding properties of collagenase and fibrinolysin/desozyribonuclease. Arch. Dermatol. Res. 1998. 290, 152−157.
  105. Michalsky J.P. et.al. A Modified Double Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Measurement of Alpha-1 Antitrypsin in Biologic Fluids. J. of Immunol. Meth. 1985. 83, 101−112.
  106. Naili S-, Oddou C., Gciger D. A method for the determination of mechanical parameters in a porous elastically deformable medium: applications to biological soft tissues. Int. J. Solids Structures. 1998. 35, 4963−4979.
  107. Naji L. et.al. C-13 relaxation studies on the cartilage and cartilage components. Carbohydrate Research. 2000. 327, 439−446.
  108. Neame P.j., Tapp H., Azizan A. Noncollagenous, nonproteoglycan macromoleculas of cartilage (review). Cell.Mol.Life.Sci. 1999. 55, 1327−1340.
  109. Nemes C., Ramsden J.J., Rozlosnik N. The unfolding of native laminin investigated by atomic force microscopy. Physica A. 2002. 313, 578−586.
  110. Nieminen J.H. et.al. Real-time ultrasound analysis of articular cartilage degradation in vitro. Ultrasound in Med. & Biol. 2002. 28(4), 519−525.
  111. Niimi T., Kitagawa Y. Distinct roles of mouse laminin beta-1 long arm domains for alphalbetalgammal trimer formation. FEBS Lett. ?997. 400, 71−74.
  112. Nomizu M. et.al. Active peptides from the carbozyl-terminal globular domain of laminin alpha-2 and Drosophila alpha chains. FEBS Lett. 1996. 396, 37−42.
  113. Noyori K., Takagi T., Jasin H.E. Characterization of the macromolecular component of the articular cartilage surface. Rheumatol. Int. 1998. 1 8, 71 -77.
  114. Olson S.T. et.al. Role of the catalytic serine in the interactions of serine proteinases with protein inhibitors of the Serpin family. / Biol. Chem. 1995. 270(50), 30 007−30 017.
  115. O’Malley K.M. et.al. The kinetic mechanism of Serpin-proteinase complex formation./. Biol. Chem. 1997. 272(8), 5354−5359.
  116. Ottonello L. et.al. Activation of neutrophil respiratory burst by cytokines and chemoattractants. Regulatory role of extracellular matrix glycoproteins. Inflamm. Res. 1998. 47, 345−350.
  117. Ozcan C. et.al. Enzymatic debridement of burn wouns with collagenase in children with partial-thickness burns. Burns. 2002. 28, 791−794.
  118. Ozer I. Kinetic analysis of enzyme inactivation under second-order conditions by use of substrate-to-product progress curves: application to the inhibition of trypsin by alpha-1 proteinase inhibitor. Anal Biochem. 1998. 264(2), 199−203.
  119. Papadopoulos S. et.al. Radial and longitudal diffusion of myoglobin in single living heart and skeletal muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. 98(10), 5904−5909.
  120. Papazian H.A., Mason L.W. Osmosis and microgravity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. 164(1), 351−354.
  121. Petersen W., Tillmann B. Blood and lymph supply of the posterior cruciate ligament: a cadaver study. Knee Surg. 1999. 7, 42−50.
  122. Petterson G. Effect of evolution on the kinetic properties of enzymes. Eur. J. Biochem. 1989. 184, 561−566.
  123. Phillips R.G., Deen W.M., Brady J.F. Hindered transport of spherical macromolecules in fibrous membranes and gels. AIChE J. 1989. 35, 1761−1769.
  124. Phillips R.G., Deen W.M., Brady J.F. Hindered transport of spherical macromolecules in fibrous membranes and gels: effect of solute size and fiber configuration. J. Colloid Interface Sci. 1990. 139, 363−373.
  125. Pirot F. et.al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. 94, 1562−1567.
  126. Pos O. et.al. Changes in the serum concentration and the glycosylation of human alpha-1 acid glycoprotein and alpha-1 protease inhibitor in severely burned persons: relation to interleukin-6 levels. Clin. Exp. Immunol. 1990. 82(3), 579−582.
  127. Prager M.D., Herring M., Germany B., Baxter C.R. Elastase and alpha-1 proteinase inhibitor in burn wound exudates. J. Burn Care Rehabil. 1991. 12(4), 300−305.
  128. Raabe E.H., Yoshida K., Schwarting G.A. Differential laminin isoform expression in the developing rat olfactory system. Dev. Brain Biol. 1997. 101, 187−196.
  129. Reinert T. et.al. Visualization of collagen fibrils in joint cartilage using STIM. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 2001. 181,511−515.
  130. Rinehart A.R., Mallya S., Simon S.R. Human alpha 1 proteinase inhibitor binds to extracellular matrix in vitro. Am. J.Respir. Cell.Mol.Biol. 1993. 9(6), 666−679.
  131. Rogues C. Massage applied to scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 126−128.
  132. Roques C. Pressure therapy to treat burn scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 122 125.
  133. Rosenberg, Damus. The purification and mechanism of action of human thrombin-heparin cofactor. J. of Biol. Chem. 1973. 248, 6490.
  134. Rudenskaya et. al. Isolation and properties of Trypsin PC from the king crab Paralithodes camchatica. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 1998. 24(2), 98−104.
  135. Ruoslanti et.al. Extracellular matrices and cell adhesion. Arteriosclerosis. 1985. 5, 581−594.
  136. Sakharov D.V. et.al. Two-step targeting of urokinase to plasma clot provides efficient fibrinolysis. Thromb. Res. 1988. 49, 481−488.
  137. Sakharov D.V. et.al. Fibrin-specificity of a plasminogen activator affects the efficiency of fibrinolyaia and responsiveness to ultrasound: comparison of nine plasminogen activators in vitro. Thromb. Haemost. 1999. 81(4), 605−612.
  138. Sakharov D.V., Lijnen H.R., Rijken D.C. Interactions between staphyllokinase, plasmin (ogen) and fibrin. J. Biol. Chem. 1996. 271(44), 27 912−27 918.
  139. Sakharov D.V., Nagelkerke J.F., Rijken D.C. Rearrangenents of the fibrin network and spatial distribution of fibrinolytic components during plasma clot lysis. J. Biol. Chem. 1996. 271(4), 2133−3138.
  140. Sakharov D.V., Plow E.F., Rijken D.C. On the mechanism of the antifibrinolytic activity of plasma carboxypeptidase B. J. Biol. Chem. 1997. 272(22), 14 477−14 482.
  141. Sakharov D.V., Rijken D.C. Superficial accumulation of plasminogen during plasma clot lysis. Circulation. 1995. 92, 1883−1890.
  142. Sakharov D.V., Rijken D.C. The effect of flow on lysis of plasma clots in a plasma environment. Thromb. Haemost. 2000. 83(3), 469−474.
  143. Sakharov I.Ju., Shekhonin B.V., Glyantzev S.P., Litvin F.E. Immunohistochemical study of purulent wounds treated with King crab collagenasc. Exp. Dermatol. 1994. 3, 51−55.
  144. Salmivirta K. et.al. Binding of mouse nidogen-2 to basement membrane components and cells and its expression in embryonic and adult tissues suggest complementary functions of the two nidogens. Exp. Cell Res. 2002. 279, 188−201.
  145. Saylam C. et.al. Distribution of fibronectin, laminin and collagen type IV in the materno-fetal boundary zone of the developing mouse placenta. Arch. Gynecol. Obstet. 2002. 266,83−85.
  146. Schaefer B.M. et.al. Alpha-2 antiplasmin and plasminogen activator inhibitors in healing human skin wounds. Arch. Dermatol. Res. 1996. 288, 122−128.
  147. Schechter N.M. et.al. Diverse effect of pH on the inhibition of human chymase by Serpins. J. Biol. Chem. 1997. 272(39), 24 499−24 507.
  148. Schiffmann Y. The second messenger system as the morphogenetic field. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989. 165(3), 1267−1271.
  149. Schmehl K. et.al. Deficiency of epithelial basement membrane laminin in ulcerative colitis affected human colonic mucosa. Int. J. Colorectal Dis. 2000. 15, 39−48.
  150. Schwindt D.A., Wilhelm K.P., Maibach H.I. Water diffusion characteristics of human stratum corneum at different anatomical sites in vivo. J. Invest. Dermatol. 1998. Ill, 385−389.
  151. Shapiro S.D., Senior R.M. Matrix metalloproteinases: matrix degradation and more. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1999. 20, 1100−1102.
  152. Sherman R. Maggot versus conservative debridement therapy for the treatment of pressure ulcers. Wound Rep. Reg. 2002. 10, 208−214.
  153. Stanley J.R. et.al. Structure and Function of Basement Membrane. J. of Invest. Dermatol. 1982. 79(S1), 69−72.
  154. Tanaka T. Gels. Sci. Am. 1981. 244, 124−138.
  155. Teot L. Clinical evaluation of scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 93−97.
  156. Terranova V.P., Hujanen E.S., Martin G.M. Basement Membrane and the Invasive Activity of Metastatic Tumor Cells. JNCI. 1986. 77(2), 311−316.
  157. Tompkins R.G., Schnitzer J.J., Yarmush M.L. Macromolecular transport within heart valves. Ore. Res. 1989. 64, 1213−1223.
  158. Tsonis A. A., Eisner J.B., Tsonis P.A. On the dynamics of a forced reaction -diffusion model for biological pattern formation. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. 86, 4938−4942.
  159. Tsu C.A., Craik C.S. Substrate Recognition by Recombinant Serine Collagenase 1 from Uca pugilator J.Biol.Chem. 1996. 271(19), 11 563−11 570.
  160. Tsu C.A., Perona J.J., Schellenberger V., Turck W» Craik C. The Substrate Specificity of Uca pugilator Collagenolytic Serine Protease 1 Correlates with the Bovine Type I Collagen Cleavage Sites. J.Biol.Chem. 1994. 269(30), 19 565−19 572.
  161. Tsu et.al. Structural basis for the broad substrate specificity of Fiddler crab collagenolytic serine protease 1. Biochem. 1997. 36, 5393−5401.
  162. Wright J.B. et.al. Early healing events in a porcine model of contaminated wounds: effects of nanocrystalline silver on matrix metalloproteinases, cell apoptosis, and healing. Wound Rep. Reg. 2002. 10, 141−151.
  163. Yurchenco, Schittny. Molecular architecture of basement membranes. FASEB Journal. 1990. 4, 1577−1590.
  164. Zouboulis C.C. et.al. Current developments and uses of cryosurgery in the treatment of keloids and hypertrophic scars. Wound Rep. Reg. 2002. 10(2), 98−102.
Заполнить форму текущей работой

Сдать сессию!