Исследование действия биоцидов на эколого-функциональное состояние микроводоросли Chlorella pyrenoidosa: на примере полигексаметиленгуанидинов

Рост антропогенных загрязнений в окружающей среде может прямо или косвенно сопровождаться либо адаптацией экологических систем к новым условиям существования, либо их деградацией.

Своевременное обнаружение деградации водных экосистем, обусловленной воздействием антропогенных факторов, а также химический и биологический мониторинг, возможно, позволит своевременно предсказать и избежать как первичных нарушений в трансформации вещества и энергии, так и отдаленные последствия действия загрязнений.

В настоящее время создается и производится много флокулянтов. Наиболее распространенными являются полиакриламиды. К другому классу относятся соединения группы гуанидинов. Наши знания о влиянии этих веществ на водоемы ограничены. Гуанидины и их производные, в частности полигексаметиленгуанидины (ПГМГ), разрешены для использования Минздравом РФ в качестве дезинфицирующих средств в быту, медицинских, фармацевтических, пищевых, сельскохозяйственных и кожевенных учреждениях, при чрезвычайных ситуациях, а также в качестве дезинфицирующих добавок в питьевую воду вместо хлора. Как правило, ПГМГ используются в качестве водорастворимых солей — ПГМГ-гидрохлорида (ПГМГ-хлорида) и ПГМГ-фосфата и композиционным составам, включающим ПГМГ в качестве действующего вещества (Кузнецов, 2002).

В настоящее время освоен промышленный выпуск ПГМГ и его производных (Федорова, 2004; Кошелева, 2005; Гембицкий, 1998; Скворьрва, 1975; Дез средства, Справочник 1998; гигиенический сертификат № 19.ФЦ.03.940.П254 781Д7 от 27.06.97- Усатенко, Суржик, 1999). Гуанидины обладают высокой физиологической активностью (фунгицидной, бактерицидной, гербицидной) (Кузнецов, 2002). Такой широкий спектр свойств гуанидинов и доступность их в настоящее время, в связи с возможностями отечественного производства, обуславливает интерес к ним, как к возможному фактору загрязнения окружающей среды, в частности водной.

Токсичность ПГМГ-гидрохлорида не привлекает должного внимания ввиду отсутствия ее для теплокровных животных, а также отсутствия цвета и запаха, (санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.01.03.249. П. 7 289.03.1 от 13.03.01- www.intercid.ru, 2004; Хаширова, 2002), нелетучести, хорошей растворимости в воде, устойчивости при хранении. К тому же, ПГМГ не вызывают аллергию у людей, обесцвечивание тканей и коррозию оборудования (Данилина, 1993).

При борьбе с патогенной микрофлорой, ПГМГ одновременно подавляет микрофлору экосистем. Уже в небольших концентрациях ПГМГ может быть опсен для микроорганизмов, в частности для микроводорослей. Водоросли являются первым звеном трофической цепи водных экосистем, основным источником вновь синтезированного органического вещества. (Усатенко, Суржик, 1999) К тому же, планктонные водоросли, в частности хлорококковые, играют большую роль в биологической очистке стоков (Афанасьева, Телитченко, 1980; Костяев, 1972).

Биоцидные свойства ПГМГ и расширяющиеся масштабы его использования заставляют оценивать возможные последствия его попадания в стоки и, следовательно, в водоемы. Возможные пути действия ПГМГ на бактерии рассматриваются как физико-химический процесс адсорбции на поверхности клеток, диффузии через мембрану и нарушение проницаемости (Кузнецов, 1990).

В литературе достаточно широко представлены результаты влияния ПГМГ на гидробионтов, в частности, рыб, рачков, простейших, а также бактерий, вирусов (Баркова, 1991; Гембицкий, 1998; Пантелеева, 1999; Скворцоеа, 1975; Ефимов, Гембицкий, 2000; Кузнецов, 1990; Воинцева, Поликарпов, 2006) При этом, исследования воздействия полигексаметиленгуанидинов на развитие и функциональное состояние водорослей практически отсутствуют.

Перспективным направлением изучения функционального состояния одноклеточных водорослей является поведение клеток при прохождении через нее переменного электрического тока в зависимости от его частоты. При этом регистрируются и анализируются диэлектрические свойства в широком диапазоне частот. В общем случае диэлектрические свойства определяются двумя основными параметрами клеток — сопротивлением R (проводимостью а), и емкостью С (диэлектрической проницаемостью е), величины которых зависят от частоты электрического поля и состояния внешних мембран (Шван, 1963; Grimmes, Martinsen, 2005; Pethig, Kell, 1987). В отличие от микроэлектроднх методов, измерение электрических параметров не повреждает клетки, что позволяет изучать целые клетки без нарушения их структуры. Зависимость электрических свойств от частоты позволяет путем выбора соответствующих диапазонов измерений и исследуемых параметров провести детальный анализ функциональных характеристик клеток водорослей и их внешних мембран.

В связи с этим, в настоящей работе представлены результаты изучения электрических свойств одноклеточной водоросли Chlorella pyrenoidosa при воздействии на нее ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата.

Исследование направлено на объективную оценку функционального состояния клеток и последствий действия ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на главный барьер проницаемости и определения возможных механизмов воздействия на водоросли, которые являются основой функционирования водных экосистем. Проницаемость клеток растений связана с энергообеспечением клетки, а АТФ является связующим звеном между фотосинтетическими реакциями и транспортными процессами в мембранной системе (Альварес, 1982; Spanswick, 1972). В работе представлены также результаты воздействий ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на фотосинтетические характеристики водоросли Chlorella pyrenoidosa, в частности, на активность фотосистемы II (ФС II), которая в значительной степени определяет первичную продукцию (Baker et al., 1989; Oquistetal., 1982; Krall, Gerald, 1992; Маторин, 1993).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

6. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.

1. При действии биоцидов ПГМГ во всех исследованных концентрациях наблюдали подавление роста численности культуры С. pyrenoidosa с 6−12 сут. развития, которое зависело от времени контакта с клетками При концентрации ПГМГ-фосфата 0,05 мг/л в период 3−12 сут. культивирования наблюдали стимуляцию роста численности клеток, которая достигала на 12 сут. 122,6% от контроля. Для ПГМГ-гидрохлорида даже при 0,005 мг/л стимуляции не наблюдались и численность составила 63,4% от контроля, а для максимальной 0,5 мг/л -16%. Альгицидная активность ПГМГ-гидрохлорида в 10 раз выше, чем ПГМГ-фосфата.

2. Анализ кривых зависимости Gs и Cs на низких и высоких частотах показал, что для растущей культуры C. pyrenoidosa область дисперсии находится в диапазоне частот от 10 кГц до 10 МГц, с максимумом в области 500 кГц — 1 МГц, что соответствует положению (3-дисперсии. Кривые частотной зависимости (1 кГц — 10 МГц) величины Rs, и tg5 указывают, что наиболее активными являются клетки с 3 по 7 сут. Это подтверждает величина Кп, которая изменялась при развитии культуры от 6 до 2,2.

3. Развитие культуры водоросли сопровождается изменением активных и пассивных транспортных процессов через мембраны клеток, причем на 5−7 сут активный перенос ионов преобладает над пассивной проницаемостью, С 3 по 5 сут интенсивный рост клеток сопровождается их повышенной метаболической активностью и увеличением а-параметра, в результате чего происходит активное накопление ионов, что отражается в снижении R0 и одновременном росте Rj.

4. Анализ кривых зависимости Rs от частоты (10 кГц-10 МГц) показал, что присутствие в среде Chlorella как ПГМГ-фосфата, так и ПГМГ-хлорида в концентрациях 100- 500 мг/л или 50−100 мг/л соответственно вызывало изменение в характере кривой дисперсии, особенно на низких частотах, что означает увеличение проницаемости мембран клеток. Частотные зависимости величины tg8 для суспензии клеток в присутствии биоцидов ПГМГ указывают на большую альгицидную активность хлористого соединения.

5. Из анализа комплексной импедансной диаграммы следует, что влияние ПГМГ-фосфата сказалось в снижении, при росте концентрации от 100 до 500 мг/л только величины RM, тогда как величина Rj при этом не менялась. Величина фазового угла мембраны составляла 67° против 73° в контроле независимо от концентрации. Влияние ПГМГ-фосфата сказывалось в повышении проницаемости мембран клеток водоросли, степень которого возрастала с увеличением концентрации.

6. ПГМГ-хлорид, вызывал снижение величины RM, а также Rj. Величина фазового угла мембраны варьировала от 82° (при 50 мг/л) до 63° (при 100 мг/л). ПГМГ-хлорид приводил к снижению проницаемости мембран при 50 мг/л и частичному разрушению клеток при 100 мг/л. Как ПАВ, ПГМГ-биоциды могут избирательно влиять на проницаемость путем изменения транспортных процессов. Различия в действии ПГМГ-фосфата и ПГМГ-хлорида, видимо, обусловлены неодинаковым защитным эффектом функциональных групп, причем влияние гидрохлорида менее выражено.

7. Анализ полученных зависимостей основных показателей (Rs, Cs и tgS) электрических свойств клеток Chlorella от концентрации биоцидов показал, что наиболее оптимальным параметром следует считать величину Rs, на фиксированной частоте 100 кГц. Линейная зависимость изменения величины Rs от концентрации биоцидов ПГМГ на 100 кГц, позволяет рассматривать данный методический приём как адекватный для биотестирования или токсикометрии.

8. При кратковременном воздействии низких концентраций ПГМГ-гидрохлорида (Ю'МО" 1 мг/л) в клетках водоросли изменялась скорость транспорта электронов на акцепторной части ФС 2 и усиливалась энергизация тилакоидных мембран. При содержании биоцида выше 10″ 1 мг/л резко усиливалось ингибирование фотосинтеза и происходило уменьшение эффективного размера светособирающей антенны ФС 2. Суточная инкубация Chlorella с ПГМГ вызывала необратимую деструкцию ФС 2 и, очевидно, всего ФА.

5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Полигексаметиленгуанидины (ПГМГ) имеют широкий спектр биоцидиого действия и используются во многих отраслях промышленности. Гербицидные свойства ПГМГ, расширяющиеся масштабы его использования обуславливает интерес к нему, как к возможному фактору загрязнения водной среды. Мономеры и полимеры гуанидинов из-за присутствия функциональных групп способны к различным модификациям. Благодаря полимерной природе они обладают катионными поверхностно-активными свойствами и в процессах подготовки воды служат одновременно катионным флокулянтом и биоцидом.

Существенно, что полигексаметиленгуанидин относится к классу катионных полиэлектролитов. В связи с тем, что в его химической формуле гуанидиновые группировки чередуются с шестью метиленовыми, он имеет свойство дифильности. Таким образом, макромолекула ПГМГ представляет собой сбалансированную систему, в которой гуанидиновая группировка несет положительный заряд и обеспечивает бактерицидные свойстваанион оказывает влияние на степень делокализации положительного заряда и тем самым контролирует токсичностьгексаметиленовая цепочка способствует перераспределению электронной плотности в макромолекуле и, кроме того, регулирует гидрофильно-гидрофобный баланс молекулы.

Попадая в водоемы со сточными водами эти соединения, подобно их природным аналогам, вовлекаются в естественный круговорот веществ. В связи с этим, исследование их взаимодействия на фотосинтезирующие организмы представляет особенный интерес, поскольку оно напрямую связано с продуктивностью, возможностями самоочищения, а также с особенностями функционирования организмов в условиях загрязнения.

При действии биоцидов ПГМГ во всех исследованных концентрациях наблюдали подавление роста численности культуры С. pyrenoidosa с 3−6 суток развития, что свидетельствует о том, что препараты эффективнее при увеличении времени контакта с клетками водоросли, а альгицидная активность ПГМГ-гидрохлорида в 10 раз выше, чем ПГМГ-фосфата.

К числу наиболее перспективных методов исследования относится пока мало изученное поведение клеток водоросли при прохождении через них электрического тока в зависимости от его частоты, то есть оценка их электрических свойств. Анализ кривых зависимости Gs и Cs на низких и высоких частотах показал, что для суспензии клеток водоросли область дисперсии находится в диапазоне частот от 10 кГц до 10 МГц, с максимумом в области 500 кГц — 1 МГц, что соответствует положению (3-дисперсии. Кривые частотной зависимости (1 кГц — 10 МГц) величины Rs, и tg5 суспензии клеток микроводорослей в процессе культивирования указывают, что наиболее высокий уровень функциональной активности и жизнеспособности у клеток культуры Chlorella в экспоненциальную фазу роста.

Рост и развитие культуры водоросли сопровождается изменением как активных, так и пассивных транспортных процессов через мембрану клеток, причем на 5−7 сут активный перенос ионов преобладает над пассивной проницаемостью, а на 3 и 11 сут уровень функционирования активных транспортных процессов минимален. В период роста культуры с 3 по 5 сут наблюдается обратный процесс: активный рост клеток сопровождается их повышенной метаболической активностью и увеличением а-параметра, в результате чего происходит интенсивное накопление питательных веществ из окружающей среды, в том числе и ионов, находящее отражение в снижении сопротивления межклеточной среды R0 и одновременном росте R-.

Результаты измерений частотной зависимости (10 кГц-10 МГц) сопротивления Rs суспензии в присутствии в среде биоцидов ПГМГ показали, что присутствие в среде как ПГМГ-фосфата, так и ПГМГхлорида вызывало изменение в характере кривой дисперсии, причем более выраженное на низких частотах, чем на высоких. Это является свидетельством того, что и ПГМГ-фосфат, и ПГМГ-хлорид вызывали однонаправленное и сравнимое изменение проницаемости мембран клеток водоросли, несмотря на большую концентрацию ПГМГ-фосфата, чем ПГМГхлорида. Характерные кривые частотной зависимости величины tgS для суспензии клеток водоросли на фоне присутствия биоцидов также подтверждают большую альгицидную активность хлористого соединения, чем фосфорного.

Комплексная импедансная диаграмма Коула-Коула, построенная по результатам измерений, представлена на рис. 8. Из нее следует, что влияние ПГМГ-фосфата сказалось в снижении, по сравнению с интактными клетками суспензии, при повышении концентрации от 100 до 500 мг/л только величины сопротивления мембраны RM, тогда как величина сопротивления внутреннего содержимого клеток RBH при этом оставалась неизменной. Величина фазового угла мембраны составляла 67° (73° для суспензии интактных клеток) и продолжала оставаться неизменной при увеличении концентрации ПГМГ-фосфата в среде. Таким образом, можно полагать, что влияние ПГМГ-фосфата при использованных в экспериментах концентрациях сказывалось в повышении проницаемости мембран клеток водоросли без нарушения целостности клетки, степень которого возрастала с увеличением содержания ПГМГ-фосфата в среде.

Принципиально иной характер влияния на мембрану клеток водоросли оказывал ПГМГ-хлорид. Анализ зависимости импедансных диаграмм от концентрации в среде ПГМГ-хлорида в пределах от 50 до 100 мг/л показал, что его действие приводило как к снижению величины сопротивления мембраны клеток RM, так величины внутреннего содержимого клеток RBH. Величина фазового угла мембраны при этом варьировала от 82° (при 50 мг/л) до 63° (при 100 мг/л).

На основании полученных результатов при измерении электрических свойств водоросли были выявлены возможные механизмы действия ПГМГ-фосфата и ПГМГ-гидрохлорида, как поверхностно-активных веществ (ПАВ), на мембраны клеток водоросли, избирательно влияющих на проницаемость клеточных мембран, когда включение ПАВ в мембраны эффективно изменяет транспортные процессы. Ион или молекула ПАВ, сорбируясь на мембране, внедряется в нее своей липофильной частью, в результате чего прочность мембраны резко падает и она разрушается. Способность ПАВ солюбилизировать липидные компоненты мембраны в первую очередь связана с концентрацией действующего вещества. В том случае, когда концентрация ПАВ достаточна для конформационных изменений и дестабилизации мембраны, наступает лизис клетки. При этом мембраны дезинтегрируются, перестраиваясь в смешанные мицеллы, содержащие ПАВ-липидные и ПАВ-белковые комплексы.

Рассматривая с этих позиций различия в механизме действия ПГМГ-фосфата и ПГМГ-хлорида, можно полагать, что они обусловлены неодинаковым защитным эффектов фосфатных и хлористых групп ПАВ, причем влияние последних выражено существенно меньше. Другим не менее важным аспектом действия ПАВ на клетки при более низких концентрациях является их влияние на процессы метаболизма, которые связаны с транспортом веществ, реакций окислительного фосфорилирования и фотосинтеза. Выявленный характер изменений функционального состояния клеточной мембраны позволяет рассматривать ПГМГ-гидрохлорид как обладающего большим повреждающим действием на мембраны клеток водоросли, чем ПГМГ-фосфат.

Проницаемость клеток растений связана с энергообеспечением клетки, а АТФ является связующим звеном между фотосинтетическими реакциями и транспортными процессами в мембранной системе. В связи с этим, в работе представлены также результаты воздействий ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на фотосинтетические характеристики водоросли Chlorella pyrenoidosa, в частности на активность ФС 2, которая определяет, в основном, первичную продукцию.

При развитии культуры C. pyrenoidosa в контроле в экспоненциальную фазу (Fv/Fm), который отражает активность ФС 2, СВК были максимальны на 3−5 сут. и после 7 сут. снижались. При кратковременном воздействии низких концентраций ПГМГ (10″ 3−10″ ' мг/л) в клетках водоросли происходило изменение световых реакций фотосинтеза, в частности изменялась скорость транспорта электронов на акцепторной части ФС 2 и усиливалась энергизация тилакоидных мембран хлоропластов. При содержании ПГМГ выше 10″ 1 мг/л резко усиливалось ингибирование фотосинтеза и происходило уменьшение эффективного размера светособирающей антенны ФС 2. Суточная инкубация хлореллы в присутствии ПГМГ вызывала необратимую деструкцию ФС 2 и, очевидно, всего ФА. При изучении биологической активности веществ антропогенного происхождения следует учитывать, что первичные реакции фотосинтеза, являющиеся частью и пусковым механизмом всей разветвленной системы метаболизма фотосинтезирующих организмов, значительно более чувствительны, чем реакции темнового метаболизма.

Следовательно, при изучении биологической активности веществ антропогенного происхождения следует учитывать, что первичные реакции фотосинтеза, являющиеся частью и пусковым механизмом всей разветвленной системы метаболизма микроводорослей, значительно более чувствительны, чем реакции темнового метаболизма. Затем функциональное состояние клеток водоросли С. pyrenoidosa при действии биоцидов типа биоцидов ПГМГ определяется энергозависимыми процессами, управляющими проницаемостью внешних клеточных мембран, как это следует из данных электроспектроскопии.