Функционирование митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала при различных физиологических и патологических состояниях

Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал (митоКдгф), осуществляющий вход калия в митохондрии, был обнаружен относительно недавно методом пэтч-кламп во внутренней мембране митохондрий [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой из внутренней мембраны митохондрий был выделен белок м.м. ~60 кДа, обладающий свойствами данного канала [Миронова и др., 1981], и при реконструкции в БЛМ ингибируемый физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996.

I)].

В настоящее время к этому каналу привлечено внимание большого числа исследователей, как в области биоэнергетики, так и медицины, поскольку почти сразу после его обнаружения в клетке было установлено, что он играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [McCullough et al., 1991; Gross G. et al., 1992; Grover et al., 1994; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. В частности, было показано, что введение животным фармакологических активаторов митоКатф непосредственно перед продолжительной ишемией оказывает эффект, подобный ишемическому прекондиционированию, т. е. приводит к положительным экспериментальным и клиническим результатам, таким как сокращение зоны инфаркта и восстановление ритма сердца, тогда как введение ингибитора канала предотвращало ишемическую прекондицию [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Tsai et al., 2002; Krylova et al, 2006]. Однако, механизм такой кардиопротекции до сих пор не вполне понятен и требует изучения.

Биофизические свойства данного канала и его физиологическая роль в настоящее время достаточно хорошо исследованы [Inoue et al., 1991; Миронова и др., 1996 (I, И) — Garlid et al., 1997; Grigoriev et al., 1999; Mironova et al., 1999; 2004]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоКдтф, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Показано, что ряд гормонов могут активировать этот канал [Tsai et al., 2002; Er et al., 2004; Nishida et al., 2009]. Ведется поиск других эффективных метаболических активаторов митоКЛГФ, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать, и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Недавно в нашей лаборатории был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКдтф — уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004] и показано эффективное антиишемическое и антиаритмическое действие его предшественников — уридина и уридин-5 монофосфата (УМФ) на модели острого инфаркта миокарда у крыс [Krylova et al., 2006]. Известно, что уридин, в отличие от самого УДФ, проникает в клетку [Matsushita et at., 1970]. Кроме того, в нашей же лаборатории было обнаружено, что при стимуляции работы митоКдтф активируется и система выхода калия из митохондрий в обмен на протон [Mironova 2007]. На основании выше указанных данных, было сделано предположение, что результатом активации рециклизации калия в митохондриях может быть снижение интенсивности окислительного стресса и, как следствие, восстановление энергетического баланса в ишемизированном миокарде.

По данным ряда исследователей [Ferranti R. et al, 2003; Garlid et al., 2003], митоКАТФ может регулировать продукцию активных форм кислорода, генерация которых существенно возрастает как при ишемии, так и в процессе старения организма. Поскольку при старении увеличивается риск возникновения ишемических повреждений тканей, можно предположить наличие возрастных изменений в функционировании митоКдтф канала. Выявление этих изменений позволит осуществить коррекцию используемых методов кардиопротекции, а также предложить новые пути лечения сердечно-сосудистых заболеваний и ишемических повреждение различных тканей.

Ранее было показано, что усиление процесса транспорта катионов и, в частности, калия в митохондриях имеет первостепенное значение для поддержания теплообразования в некоторых тканях гибернирующих животных, обеспечивая интенсивный несократительный термогенез при пробуждении в условиях неактивной митохондриальной АТФ-синтетазы при низких температурах тела (2−25°С) [Миронова и др., 1986]. Изучение особенностей АТФ-зависимого транспорта К+ у гибернирующих животных, находящихся в различных физиологических состояниях, начатое ранее в нашей лаборатории Федотчевой Н. И. [Fedotcheva et al., 1985], позволит лучше понять механизмы несократительного термогенеза при разогреве зимоспящих животных от критически низких температур до температуры тела.

В связи с вышеуказанным, в настоящей работе был исследован механизм кардиопротекторного действия физиологического активатора канала — уридин-5'-дифосфата при ишемии миокарда. Также изучены особенности функционирования митоКатф при некоторых физиологических и метаболических состояниях организма и его роль в повышении общей долгосрочной толерантности организма к гипоксическим условиям и процессе терморегуляции.

Цель работы: изучить механизм кардиопротекторного действия активаторов митоКатф при ишемии, а также функциональную роль канала при ряде патологических и физиологических состояний организма, в частности при старении и в терморегуляции организма.

В соответствии с целью работе были поставлены и решены следующие задачи:

1) Изучить влияние активатора митоКЛТф канала на энергетический обмен миокарда и систему антиоксидантной защиты в условиях нормоксии и острой ишемии на модели острой ишемии миокарда;

2) На модели «ишемия-реперфузия» миокарда исследовать, влияние активатора митоКатф на снижение зоны инфаркта, подобрав при этом оптимальную схему его введения;

3) В экспериментах in vitro и in vivo показать адаптогенный эффект активации митоКдтф в формировании долгосрочной устойчивости организма к гипоксическим условиям;

4) Выявить изменения функционирования митоКатф канала при старении организма;

5) На модели гибернирующих сусликов исследовать роль митоКатф канала в механизме несократительного термогенеза.

Новизна исследования. Впервые обнаружено, что активация митоКатф его природным активатором в условиях ишемии миокарда способствует сохранению энергетического и антиокислительного статуса миокарда. Предположено, что эти свойства канала могут лежать в основе механизма, опосредующего кардиопротекторный эффект активации митоКдтф при инфаркте миокарда. Впервые установлено антиишемическое действие метаболической активации канала на модели ишемии-реперфузии миокарда, при этом подобрана наиболее эффективная схема введения препарата. В экспериментах как in vitro, так и in vivo, впервые показан адаптогенный эффект активации митоКАТФ растительным антигипоксическим препаратом флавоноидного ряда. В данной работе впервые обнаружено снижение функционирования митоКАТф канала в митохондриях печени и сердца крыс в процессе старения организма. Также впервые показана активация цикла калия в митохондриях сердца при выходе гибернирующих животных из спячки.

Научно-практическое значение работы. Предложенный в работе механизм защитного влияния активации митоКдтф при ишемии и ишемии-реперфузии может служить основой для разработки средств профилактики и лечения ишемических повреждений миокарда. Предшественники метаболического активатора митоКАТФ, использованные в работе — уридин и уридин-5'-монофосфат, могут быть использованы для создания новых эффективных антиишемических лекарственных препаратов, действие которых опосредуется активацией митоКАтФ. Показанный в работе адаптогенный эффект активатора канала растительного происхождения открывает перспективу его использования для формирования долгосрочной толерантности организма к гипоксическим условиям. Выявленное в работе снижение функционирования митоКдтф с возрастом также позволит более четко разработать методы профилактики и, возможно, лечения ишемических повреждений миокарда. Обнаруженные изменения в функционировании канала у гибернирующих животных, находящихся в различных физиологических состояниях, помогут лучше понять механизмы несократительного термогенеза у теплокровных животных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Показано что УМФ крови может быть источником образования в клетках миокарда метаболического активатора митоКАТф каналаУДФ;

2. На модели острого инфаркта миокарда у крыс установлено, что внутривенное введение УМФ приводит к предупреждению распада макроэргических соединений (АТФ и креатинфосфата), а также гликогена в ишемизированном миокарде, за счёт активации митоКАТФ канала;

3. Показано, что активация митоКАТФ канала устраняет нарушения окислительно-восстановительных процессов в миокарде, наблюдаемые при ишемии, что лежит в основе предлагаемого в работе механизма кардиопротекторного действия активаторов канала;

4. На модели ишемия-реперфузия, также как и на модели острой ишемии, при активации митоКАТФ канала наблюдается выраженный кардиопротекторный эффект, заключающийся в снижении зоны некроза миокарда;

5. Обнаружено, что антигипоксический флавоноид-содержащий препарат растительного происхождения активирует митоКАТФ канал как в эксперименте in vitro, так и in vivo приводя, в условиях целого организма, к значительному повышению общей толерантности организма к гипоксии;

6. Установлено, что активность митоКАтФ канала значительно снижается по старения животных, что частично связано с нарушением регуляции и экспрессии белка-канала;

7. Показана значительная активация митоКАТФ канала при выходе животных из состояния спячки, частично связанная с изменением регуляции белка-канала в митохондриях, что может играть важную роль в повышении теплообразования в этом состоянии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящей работе были исследованы особенности функционирования митоКдтф при разных метаболических (старение, гибернация) и патологических (острая ишемия, ишемия-реперфузия) состояниях организма.

Ранее в нашей лаборатории был обнаружен метаболический активатор митоКатф — уридин-5'-дифосфат (УДФ), который, однако, не способен транспортироваться в клетку через клеточную мембрану из плазмы крови. Из литературы было известно, что один из предшественников УДФ — уридин способен свободно проникать в клетку [Matsushita et al., 1970], однако в отношении УМФ такой способности ранее показано не было.

В данной работе показано увеличение пула уридиновых нуклеотидов в миокарде при внутривенном введении УМФ. В состоянии острой ишемии, по сравнению с состоянием нормоксии этот пул увеличивается, особенно за счет фракции УДФ, который, как сказано выше, является активатором митоКЛТФ. Активация же митоКЛТФ при введении УМФ, как было нами показано ранее [Krylova et al., 2006], имеет ярко выраженный кардиопротекторный эффект, который заключается в уменьшении индекса ишемической альтеррации миокарда и нормализации ритма. Однако механизм, посредством которого активация митоКЛТФ приводит к защите миокарда от ишемических повреждений, был не вполне понятен.

Известно, что одним из негативных последствий ишемии миокарда является существенное падение уровня макроэргов в клетке, в частности АТФ и креатинфосфата. В результате проведенных исследований было выяснено, что предварительное введение животным УМФ за 5 минут до окклюзии ЛКА, способствующего активации митоКАТФ, приводило к восстановлению количества креатинфосфата и АТФ в ишемизированном миокарде до уровня контроля. При введении препарата УМФ на фоне селективного ингибитора митоКдтф — 5-гидроксидеканоата уровень обоих макроэргов в миокарде снижался до величин, наблюдаемых в условиях острой ишемии. Следовательно, активация митоКатф в кардиомиоцитах в условиях ишемии оказывает выраженное энергосберегающее действие.

Одним из способов активации энергетического обмена в ишемизированной ткани является поддержание субстратного обеспечения гликолиза, который играет важную роль в образовании макроэргических соединений в кардиомиоцитах. В условиях ишемии запасы субстратов гликолиза (глюкозы и гликогена) быстро истощаются. Проведенные исследования показали, что при введении УМФ происходит нормализация содержания гликогена в миокарде, однако ингибитор митоКдтф — 5-ГД практически не обращает этот эффект, свидетельствуя об отсутствии влияния активации митоКАТФ канала на этот процесс. По всей видимости, это происходит за счет увеличения в клетке, при введении животным УМФ, УДФ-глюкозы, используемой для синтеза гликогена.

При ишемии, помимо снижения в миокарде количества макроэргов и субстратов гликолиза и окислительного фосфорилирования, увеличивается интенсивность окислительного стресса, которая выражается усилением перекисного окисления липидов, снижением активности глутатионовой системы и ферментов, утилизирующих образовавшиеся АФК. Профилактическое введение УМФ, приводящее к активации митоКдтф канала, снижало уровень ГПЛ до уровня контрольных животных, предотвращало падение. уровня ВГ в миокарде в условиях ишемии и способствовало сохранению на, прежнем уровне активности СОД. Эти положительные эффекты УМФ полностью устранялись ингибитором митоКАТФ 5-ГД, что свидетельствует о сохранении равновесия процессов ПОЛ и активности антиоксидантной системы именно на фоне активации митоКЛТФ.

Механизм действия' УМФ — предшественника активатора митоКАТФ (УДФ), может быть связан с активацией всего цикла калия в митохондриях, работа которого приводит к слабому разобщению и, как следствие, предупреждает образование в митохондриях АФК. Это, в свою очередь, может предупреждать увеличение ГПЛ, восстановление глутатиона и падение активности антиоксидантных ферментов, наблюдаемые при ишемии без введения препарата.

На модели ишемии-реперфузии также было показано, что УМФ обладает кардиопротекторным эффектом УМФ. Он заключается в снижении зоны некроза миокарда, наиболее выраженном при двукратном введении препаратов: за 30 мин до окклюзии ЛЕСА и за 5 мин до реперфузии. Этот эффект может быть связан с увеличением суммарной дозы препарата или с предварительной инициацией эндогенных защитных механизмов. При этом ведущую роль в реализации антиишемичеекого действия УМФ играют митоКдтф — каналы, о чем свидетельствует отсутствие эффекта препарата при их введении на фоне селективного ингибитора 5-ГД.

Полученные в работе данные о снижении интенсивности окислительного1 стресса в условиях ишемии и сохранении высокого уровня макроэргических соединений в клетке, свидетельствуют в пользу развиваемого в лаборатории представления о механизмах кардиопротекторного действия митоКдтфСогласно нашим представлениям, введенный УМФ проникает через клеточную мембрану и фосфорилируется в клетке до УДФ, повышая его концентрацию. УДФ, будучи природным активатором митоКЛТФ [Mironova et al., 2004], приводит к его активации в миокарде. Активация! входа1 К+ в митохондрии сопровождается его выходом в обмен на Н+, то есть, активацией К+/Н±обмена в митохондриях [Schonfeld et al., 2003; Schalbuyeva. et al., 2006; Mironova et al., 2010]! Активация же цикла K+ в митохондриях приводит к их разобщению, что сопровождается снижением скорости образования, активных форм кислорода [Korshunov et' al., 1997]. Снижение генерации^ АФК предупреждает окисление белков И' липидов мембран, наблюдаемое при глубокой', гипоксии и, приводящее к некрозу ткани [Griffits & Halestrap 1995]- а также предупреждает образование в митохондриях митохондриальной. Са2±активируемой GsA-чувствительной поры, открытие которой также ведет к некрозу ткани [Crompton 1999, Kowaltovsky et al., 1998, 2001].

В экспериментах in vitro и in vivo, с использованием антигипоксических флавоноидсодержащих препаратов, было показано, что активация этими препаратами митоКдтф канала способствует увеличению долгосрочной общей толерантности организма к экстремальным гипоксическим условиям, что выражалось существенным увеличением времени потери позы и времени жизни животных на критической высоте. Таким образом, был сделан вывод, что активация канала в субкритических условиях оказывает адаптогенный эффект.

При исследовании возрастных изменений функционирования митоКдтф было показано значительное снижение активности канала по мере старения животных. В" совокупности с данными об уменьшении количества К+ в митохондриях печени и сердца старых животных это может свидетельствовать о снижении активности всего митохондриального цикла К+ при старении. Обусловлено это, как показано в работе, как некоторым снижением экспрессии митоКлтф в клетках при старении животных, так и изменениями его чувствительности к регуляторам. Транспорт К+ в митохондриях сердца при старении организма становится менее чувствительным к АТФ и, возможно, к другим регуляторам, по сравнению с митохондриями печени, что может иметь адаптивное значение в связи с необходимостью постоянной сократительной работы сердца, вне зависимости от внешних условий.

Усиление транспорта калия в митохондриях печени и сердца способствует активации термогенеза при выходе гибернирующих животных из состояния спячки, а величина активности митоКдтф коррелирует с изменениями температуры тела у гибернирующих животных. В состоянии глубокой спячки, когда все обменные процессы в организме заторможены, активность митоКдтф также очень низка, однако резко повышается во время пробуждения, когда необходим быстрый разогрев животного. Это может приводить к локальному падениюмембранного потенциала и в результате к легкому разобщению дыхательной цепи, что в свою очередь приводит к усилению теплообразования. Т.о., активация митоКдтф может являться основным механизмом, запускающим несократительный термогенез.

Таким образом, можно заключить, что активация митоКАТФ способствует защите сердца от гипоксии, предупреждает развитие ишемических повреждений миокарда, в том числе при старении, а также является важным звеном в прцессе несократительного термогенеза.