Оценка эффективности природных антиоксидантов в экспериментах IN VITRO и IN VIVO

Воздействие неблагоприятных физических и химических факторов окружающей среды на организм человека часто сопровождается интенсификацией процессов свободно-радикального окисления, и, как следствие, приводит к повреждению белков, липидов, нуклеиновых кислот, других макромолекул и мембранныхктур клетки. В защите организма от влияния токсических факторов окружающей среды одно из центральных мест на всех этапах эволюционного развития занимает универсальная антиоксидантная система, существующая во всех типах клеток и представленная ферментативным и неферментативным звеньями. Нарушение работы этой системы сопровождается накоплением экзогенных и эндогенных прооксидантов, что ведет к окислительному повреждению клеточныхктур и развитию окислительногосса [4, 7, 59, 189].

На поддержание активности системы антиоксидантной защиты на адекватном функциональном уровне оказывают влияние различные алиментарные факторы, и, если действие таких пищевых антиоксидантов, как токоферолы, аскорбиновая кислота, /З-каротин и селен изучено достаточно детально, антиоксидантная эффективность многих других минорных компонентов пищи, к числу которых относят индолы, изотиоцианаты, флавоноиды и каротиноиды, требует специальных исследований [9, 12, 41, 52]. Наибольший интерес в этом плане представляют флавоноиды и каротиноиды. Известно, что эти природные соединения играют определенную роль в системе антиоксидантной защиты, благодаря способности служить эффективными перехватчиками радикалов. Помимо этого имеются сведения о способности флавоноидов и каротиноидов оказывать модулирующее действие и на другие звенья этой системы, в частности, индуцировать активность ключевых ферментов антиоксидантной защиты и проявлять сберегающее действие по отношению к витаминам С и Е. Флавоноиды могут выступать и в качестве хелаторов ионов металлов переменной валентности, что позволяет им ингибировать процессы ПОЛ на разных стадиях [15, 56, 79, 94, 152, 225].

Среди загрязнителей окружающей среды, обладающих прооксидантными свойствами, широкой распространенностью и высокой токсичностью выделяются природные контаминанты пищевых продуктов и кормов — микотоксины, вторичные метаболиты микроскопических (плесневых) грибов [53, 111, 217]. Результаты многолетних наблюдений свидетельствуют, что в России наиболее часто обнаруживаемыми являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium — в том числе трихотеценовые микотоксины и фумонизины [30, 314]. Токсинообразование на различных субстратах в природных условиях — явление мало предсказуемое и полное предотвращение накопления микотоксинов в пищевых продуктах и поступления в организм человека практически невозможно. В связи с этим, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности, поступивших в организм токсинов. Одним из направлений может выступать пища и ее компоненты в качестве регулятора всех звеньев системы ан-тиоксидантной защиты.

Цель и задачи исследования

.

Цель работы: оценка эффективности природных антиоксидантов в различных системах окисления in vitro и в экспериментах in vivo. Задачи исследования:

На экспериментальных моделях in vitro исследовать влияние природных антиоксидантов — ликопина, дигидрокверцетина, силимарина, силибинина и олигомерных проантоцианидинов на параметры хемилюминесценции системы НЬ-Н202-люминол и резистентность микросом пе.

2+ чени к ПОЛ, индуцированному системой НАДФН-Fe ;

Изучить влияние ликопина, олигомерных проантоцианидинов, дигидрокверцетина и силимарина на антиоксидантный статус крыс и резистентность микросом к индуцированному ex vivo ПОЛ;

На моделях алиментарных микотоксикозов (вызванных фу-монизинами и трихотеценовым микотоксином Т-2 токсином) изучить влияние ликопина, олигомерных проантоцианидинов и дигидрокверцети-на на защитно-адаптационный потенциал крыс.

Научная новизна.

Получены новые данные о биохимических механизмах регуляции функциональной активности системы антиоксидантной защиты природными биологически активными веществами, такими как ликопин и флавоноиды.

Обнаружено выраженное ингибирующее действие ликопина и флавонои-дов как на свободно-радикальное окисление люминола, так и на уровень индуцированного ПОЛ микросом печени in vitro. При этом на модели НЬ-Н202-люминол наиболее выраженная ингибирующая активность обнаружена у олигомерных проантоцианидинов (ОПЦ), и значительно меньшая — у других анти-оксидантов (катехин > дигидрокверцетин > силимарин > ликопин > силиби-нин). В то же время, на модели ПОЛ микросом, индуцированного системой л i.

НАДФН-Fe, ПОЛ ингибировалось в наибольшей степени ликопином, и в меньшей степени флавоноидами (ОПЦ > силимарин > силибинин > дигидрокверцетин).

Показано, что ликопин in vivo оказывает выраженное активирующее действие на систему антиоксидантной защиты крыс, что характеризуется повышением антиоксидантной емкости плазмы (АОЕ) крови, подавлением образования продуктов ПОЛ в печени, увеличением активности глутатионтрансферазы в ци-тозоле печени. Отсутствие при этом изменений активности каталазы, глутати-онпероксидазы и глутатионредуктазы позволяет предположить, что антиокси-дантное действие ликопина связано с его прямым антирадикальным эффектом, а не с влиянием на ключевые ферменты антиоксидантной защиты.

Обнаружено in vivo выраженное активирующее действие флавоноидов на систему антиоксидантной защиты крыс, характеризующееся повышением АОЕ плазмы крови и цитозоля печени.

Впервые показана способность флавоноидов (ОПЦ, дигидрокверцетина и силимарина) при включении в корм крыс, оказывать подавляющее действие на индуцированное ex vivo ПОЛ микросом печени.

В работе дана количественная характеристика антиоксидантной активности отечественных препаратов ликопина и дигидрокверцетина in vitro и получены экспериментальные доказательства их стимулирующего действия на систему антиоксидантной защиты in vivo.

Практическая значимость работы.

В работе показана способность каротиноидов (ликопина) и флавоноидов (ОПЦ, дигидрокверцетина) снижать выраженность токсических эффектов приоритетных природных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов, таких как фумонизины и Т-2 токсин.

Полученные данные могут быть использованы при гигиеническом обосновании величин потребности в пищевых биологически активных веществах (ликопине и флавоноидах) и адекватных уровней их поступления с рационом питания.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены на Пленуме Межведомственного Научного Совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации «Угрозы здоровью человека: современные гигиенические проблемы и пути их решения» (Москва, 2002 г.), Первом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (г. Москва, 2003 г.), Международной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (г. Смоленск, 2003 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в научных рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обоснования цели и выбора методов исследования, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, включает 68 таблиц и иллюстрирована 54 рисунками.

6. ВЫВОДЫ.

1. Получены новые данные о биохимических механизмах регуляции функциональной активности системы антиоксидантной защиты природными биологически активными веществами, такими как ликопин и флавонои-ды.

2. В экспериментах in vitro выявлено выраженное ингибирующее действие ликопина и флавоноидов как на свободно-радикальное окисление люми-нола, так и на уровень индуцированного ПОЛ микросом печени. При этом на модели НЬ-НгОг-люминол наиболее выраженная ингибирующая активность обнаружена у олигомерных проантоцианидинов, и значительно меньшая — у других антиоксидантов (катехин > дигидрокверцетин > силимарин > ликопин > силибинин). В то же время, на модели ПОЛ микросом, индуцированного системой НАДФН-Fe2*, ПОЛ ингибировалось в наибольшей степени ликопином, и в меньшей степени флавоноидами (ОПЦ > силимарин > силибинин > дигидрокверцетин).

3. Ликопин in vivo оказывает выраженное активирующее действие на систему антиоксидантной защиты крыс, что характеризуется повышением общей антиоксидантной емкости плазмы крови (на 23−40%), подавлением образования продуктов ПОЛ в печени (на 38−53%), увеличением активности глутатионтрансферазы в цитозоле печени (на 22−24%). Отсутствие при этом изменений активности каталазы, глутатионпероксидазы и глута-тионредуктазы позволяет предположить, что антиоксидантное действие ликопина связано с его прямым антирадикальным эффектом, а не с влиянием на ключевые ферменты антиоксидантной защиты.

4. Флавоноиды in vivo оказывают активирующее действие на систему антиоксидантной защиты крыс, характеризующееся повышением общей антиоксидантной емкости плазмы крови (на 21−34%) и цитозоля печени (на 24−26%).

5. Впервые показана способность флавоноидов (олигомерных проантоцианидинов, дигидрокверцетина и силимарина) оказывать подавляющее действие на индуцированное ex vivo ПОЛ микросом печени (на 26−31%).

6. Впервые дана количественная характеристика антиоксидантной активности отечественных препаратов ликопина и дигидрокверцетина in vitro и получены экспериментальные доказательства их стимулирующего действия на систему антиоксидантной защиты in vivo.

7. Показана способность каротиноидов (ликопина) и флавоноидов (олиго-мерных проантоцианидинов, дигидрокверцетина) снижать выраженность токсических эффектов приоритетных природных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов, таких как фумонизины и Т-2 токсин.

8. Полученные данные могут быть использованы при гигиеническом обосновании величин потребности в пищевых биологически активных веществах (ликопине и флавоноидах) и адекватных уровней их поступления с рационом питания.

5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Первоочередная роль рациона питания заключается в обеспечении организма необходимыми пищевыми веществами для поддержания нормального функционирования его органов и систем [8, 12, 41]. Однако, помимо этого, существует ряд предположений о том, что отдельные компоненты пищи способны оказывать положительное воздействие на определенные функции-мишени в организме, модулируя их и вызывая ряд благоприятных физиологических эффектов [77,123].

Новые концепции в науке о питании привели к интенсивному изучению физиологических эффектов отдельных минорных, биологически активных компонентов пищи и их влияния на здоровье.

К числу наиболее интенсивно изучаемых биологически активных компонентов пищи относятся природные антиоксиданты, главным образом ка-ротиноиды и флавоноиды, широко представленные в растительных источниках питания. Данные многочисленных клинических и эпидемиологических исследований свидетельствуют о том, что потребление пищи, богатой каро-тиноидами и флавоноидами, может снижать риск развития многих заболеваний, в основе патогенеза которых лежит окислительная модификация липи-дов, белков, нуклеиновых кислот [40, 79, 189]. Считается, что такая взаимосвязь обусловлена высоким антиоксидантным потенциалом каротиноидов и флавоноидов и их способностью усиливать защитно-адаптационный потенциал организма [89−90, 203].

Для понимания истинного значения природных антиоксидантов в поддержании оптимального состояния здоровья и снижении риска развития заболеваний, необходимо интенсивное изучение их биодоступности, механизмов действия на функции организма, а также возможный синергизм с другими компонентами пищи и эндогенными соединениями.

Одной из задач, поставленных в данной работе было изучение антиок-сидантного потенциала таких природных соединений, как ликопин, ОПЦ, дигидрокверцетин, силимарин и силибинин в модельных системах in vitro. Использование водной гомогенной тест-системы гемоглобин-пероксид водо-рода-люминол для оценки прямого антирадикального действия позволило установить, что все исследованные природные антиоксиданты обладают способностью инактивировать ряд свободных радикалов (таких как феррил-радикалы гемоглобина, гидроксильный радикал, супероксиданион-радикал) и предотвращать развитие цепей СРР. При сравнении антиоксидантных свойств ликопина и флавоноидов по их способности задерживать развитие XJI системы НЬ-Н202-люминол, установлено, что антиоксидантная активность исследуемых природных веществ превосходит активность такого изученного соединения как аскорбиновая кислота. При этом наибольшей активностью обладают ОПЦ виноградных косточек, а антиоксидантная активность других соединений изученная в данной модельной системе уменьшалась в ряду катехин > дигидрокверцетин > силимарин >ликопин > силибинин.

Согласно данным литературы, прямое антирадикальное и антиокси-дантное действие флавоноидов зависит от их молекулярного строения — количества и взаимного расположения заместителей, главным образом ОН-групп, способных выступать в качестве доноров водорода [70, 101, 196]. ОПЦ, по своему строению представляющие полимеризованные флаванолы [15], являются мощными природными антиоксидантами [28, 237].

В данном исследовании также было обнаружено, что ликопин, представитель каротиноидов, молекула которого представляет собой длинноце-почечный полиненасыщенный хромофор, имеющий большое количество легко насыщающихся двойных связей также обладает высокой антиокси-дантной активностью, что связано с особенностями строения его молекулы [97].

Поскольку именно окислительная модификация мембран зачастую лежит в основе патогенеза многих заболеваний, особенно важным представлялось изучение способности природных антиоксидантов предотвращать пере-кисное окисление структурированных липидов мембран. Поэтому на следующем этапе работы изучали влияние ликопина и Фл на чувствительность мембран микросом печени крыс к НАДФН-индуцированному ПОЛ. Результаты этой серии экспериментов in vitro показали, что как ликопин, так и Фл снижают уровень МДА в микросомах печени крыс и степень изменений активности изучаемых ферментов микросом, что можно расценивать как торможение процесса перекисного окисления липидов микросом. Было обнаружено, что антиоксидантная активность изучаемых биологически активных соединений в использованной модельной системе индуцированного ПОЛ микросом убывает в ряду ликопин > ОПЦ > силимарин > силибинин > ди-гидрокверцетин.

Изучая влияние ликопина на развитие свободнорадикальных реакций ПОЛ липосом [21 ] установили, что ликопин, как и /3-каротин и а-токоферол, тормозит ПОЛ главным образом за счет перехвата липидных радикалов, и, возможно, за счет взаимодействия с АКМ в водной фазе. В других исследованиях [97] показали, что ликопин обладает способностью инкорпорироваться в мембрану, проникая в ее гидрофобное ядро, где и проявляет свое действие, предотвращая окисление липидов. Сопоставление полученных результатов с данными литературы позволяет предположить, что антиоксидантное действие ликопина в данной модельной системе in vitro обусловлено его способностью перехватывать липидные радикалы и прерывать окислительную цепь, в результате чего сохраняются структурные и функциональные свойства микросом.

Полученные результаты показали, что флавоноиды в данной модельной системе обладают меньшей активностью, чем ликопин. Как указано выше, антиоксидантная активность флавоноидов напрямую связана с количеством гидроксильных групп в их структуре и с их способностью выступать в качестве восстановителя (донора водорода) по отношению к свободным радикалам с образованием относительно стабильных флавоксильных радикалов, что приводит к ограничению инициации или к обрыву цепной реакции свободнорадикального окисления [70]. Так, было обнаружено, что среди флавоноидов наибольшей активностью обладают ОПЦ, полимерная полифе-нольная структура которых с множеством гидроксильных групп обеспечивает им высокую антиоксидантную емкость. В ряде работ на различных модельных системах окисления показано, что ОПЦ активно взаимодействуют с супероксид-анион радикалом и с гидроксильным радикалом и по своей ан-тиоксидантной активности превосходят витамин Е, витамин С и /3-каротин [74, 108, 136, 154]. Исследования [237] свидетельствуют, что ОПЦ способны не только восстанавливать свободные радикалы и ограничивать развитие цепи свободнорадикальных реакций, но могут также адсорбироваться на мембранах связываясь с полярными гидрофильными головками фосфолипидов и ограничивать доступ оксидантов к липидному бислою.

По данным литературы, радикал-улавливающая эффективность сили-бинина и дигидрокверцетина равна или ниже эффективности витамина Е, и, в отличие от ОПЦ они являются слабыми хелаторами ионов железа. В отдельных работах было обнаружено, что дигидрокверцетин и силибинин проявляют одинаковую антиоксидантную активность в разных модельных системах окисления [105].

Для изучения влияния природных антиоксидантов на антиоксидантный статус крыс ликопин вводили животным внутрижелудочно, а ОПЦ, дигидрокверцетин и силимарин, вносили животным в рацион в течение 2-х нед. Полученные результаты свидетельствуют, что изученные соединения оказывают положительное действие на антиоксидантный статус крыс, что в первую очередь проявлялось в увеличении антиоксидантной емкости плазмы крови и цитозольной фракции печени. Наряду с этим было обнаружено, что ликопин в использованных дозах не увеличивает резистентности микросом к окислению, индуцированному ex vivo, и не оказывает влияния на активность ферментов антиоксидантной защиты, одновременно несколько увеличивая активность цитозольной глутатионтрансферазы. Это может свидетельствовать о том, что его антиоксидантное действие связано в основном с его прямым антирадикальным эффектом, а не с действием на ферменты. Несмотря на весьма умеренное (на 22−24%) возрастание активности глутатионтрансферазы у крыс, получавших ликопин, его вклад в утилизацию продуктов ПОЛ может быть весьма значительным. Глутатионтрансферазы, аналогично глу-татионпероксидазе эффективно восстанавливают липидные пероксиды и, в отличие от пероксидазы, способны восстанавливать гидропероксиды фосфолипидов в мембранах [16]. Учитывая, что глутатионтрансферазы составляют до 10% цитозольного белка печени, их роль в регуляции процессов ПОЛ в клетке представляется весьма существенной.

Изучение влияния флавоноидов на антиоксидантный статус крыс показало, что помимо достоверного увеличения антиоксидантной емкости плазмы и цитозольной фракции печени, все они обладают способностью значительно уменьшать активность каталазы — одного из ключевых ферментов антиоксидантной защиты, ответственного за утилизацию пероксида водорода. Помимо этого, ОПЦ также вызывали достоверное снижение активности глу-татионпероксидазы, также участвующей в инактивации пероксида водорода. Так как экспрессия генов ферментов антиоксидантной защиты во многом зависит от уровня АКМ, такое влияние на эти ферменты флавоноиды оказывают по-видимому за счет способности снижать регулирующее действие АКМ, и в частности пероксида водорода, на экспрессию генов этих ферментов.

Использование системы индуцированного ПОЛ микросом позволяет оценить антиоксидантную активность природных биологически активных соединений не только in vitro, но и in vivo, однако в отличие от результатов, полученных in vitro, при введении флавоноидов в корм крыс не было обнаружено значительных различий между ними по степени выраженности влияния на индуцированное ex vivo ПОЛ микросом. Вероятнее всего это отображает их биодоступность и особенности метаболизма в организме, которые в настоящее время остаются мало изученными. Так, единичные исследования свидетельствуют, что при приеме препаратов ОПЦ в крови людей и крыс обнаруживают главным образом их мономеры и некоторые димеры, т. е. компоненты, проявляющие in vitro меньшую активность [120]. Также показано, что кишечная микрофлора способна метаболизировать ОПЦ до простых фенольных кислот, антиоксидантная активность которых значительно ниже, чем активность ОПЦ [299].

Изучение влияния природных антиоксидантов на защитно-адаптационный потенциал крыс в условиях микотоксикозов представляло интерес, так как микотоксинам отводится одно из ведущих мест в ряду приоритетных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов. Микотоксины отличаются высокой токсичностью, многие из них обладают мутагенными, канцерогенными и иммунодепрессивными свойствами [53]. Даже при наличии систем контроля за безопасностью продовольственного сырья и пищевых продуктов, сохраняется вероятность постоянного поступления с пищей микотоксинов, в количествах, которые в настоящее время нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья человека. В связи с этим, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности поступивших в организм токсинов [85, 93]. Одним из таких путей могут служить БАД к пище, и в частности природные антиоксиданты. В качестве токсических соединений были выбраны микотоксины, в основе токсического действия которых не последнюю роль играет окислительный стресс — фумо-низины и Т-2 токсин.

В ходе работы было обнаружено, что ликопин и ОПЦ оказывают положительное влияние на защитно-адаптационный потенциал крыс, резистентность к токсическому действию фумонизинов. Так, эти соединения достоверно уменьшали количество и степень выраженности макроскопических проявлений микотоксикоза, а также восстанавливали показатели анти-оксидантной емкости цитозольной фракции печени. При этом была отмечена тенденция к нормализации показателей отдельных ферментов антиоксидант-ной защиты — каталазы, глутатионтрансферазы, а также восстановленного глутатиона. Сходные результаты были получены и при оценке влияния ди-гидрокверцетина на токсичность Т-2 токсина у крыс. Было обнаружено, что при введении крысам дигидрокверцетина, в значительной степени уменьшалось количество и степень выраженности макроскопических проявления микотоксикоза, восстанавливалась сниженная антиоксидантная емкость как плазмы крови, так и цитозоля печени, достоверно снижался уровень накопления конечных продуктов ПОЛ в печени, достоверно увеличивалась активность ключевых ферментов антиоксидантной защиты. Положительное действие дигидрокверцетина на защитно-адаптационный потенциал крыс с Т-2 токсикозом характеризовалось также нормализацией активности ферментов метаболизма ксенобиотиков, осуществляющих детоксикацию Т-2 токсина в организме: карбоксилэстеразы, 1ЛЭР-глюкуронозилтрансферазы, и бензпи-ренгидроксилазы.

В заключение следует отметить, что изучение эффективности природных антиоксидантов: ликопина, ОПЦ, дигидрокверцетина и силимарина в различных модельных системах позволило заключить, что их антиоксидантная активность реализуется не только за счет инактивации АКМ, но и благодаря способности оказывать модулирующее действие на ряд ферментов антиоксидантной защиты и усиливать защитно-адаптационный потенциал крыс. Высокий антиоксидантный потенциал и доступность источников данных антиоксидантов делают возможным разработку и создание БАД к пище, обогащенных и функциональных продуктов на их основе, призванных усиливать защитные функции организма человека, повышать его сопротивляемость к действию неблагоприятных факторов внешней среды.