Интерференционные методы измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов

Актуальность темы

определяется недостаточностью разработки количественных методов исследования фазовых микрообъектов и измерения их интегральных и локальных параметров.

Фазовые микрообъекты, прозрачные для излучения. видимого оптического диапазона, широко распространены как в промышленности, так и в биологии и медицине. К ним относятся различные полимерные пленки, кристаллы, оптические микродетали, оптоволоконные изделия, и, наконец, биологические микрообъекты — клетки и др. Эти объекты описываются трехмерным (ЗБ) пространственным распределением показателя преломления п (х, у, г), с которым связаны плотность, температура, концентрация и другие физические параметры объекта [1].

При изучении фазовых объектов сразу встает задача их визуализации. На сегодняшний день она решена, широко известны следующие методы: фазовый контраст (метод Цернике), интерференционный контраст, дифференциально-интерференционный контраст (метод Номарского, ШС), метод темного поля, поляризационный контраст и пр [2]. Однако в настоящее время при исследовании фазовых микрообъектов требуется не только наблюдать и оценивать различные геометрические параметры (площадь, периметр), но и проводить измерения их локальных и интегральных характеристик.

Исходным измеряемым параметром фазового микрообъекта является оптическая разность хода (ОРХ). Это интегральная характеристика, так как ОРХ представляет собой интеграл от функции распределения показателя преломления вдоль луча или одномерную (Ш) луч-сумму. Двумерное (2Б) распределение ОРХ, полученное вдоль набора параллельных лучей является параллельной 2Б проекцией, а вдоль набора лучей, пересекающихся в одной точке — конусной 2Т> проекцией. Будем далее называть 2Б распределение ОРХ фазовым изображением.

По набору значений ОРХ, измеренных при различных углах зондирования, можно реконструировать 3D пространственное распределение показателя преломления n (x, y, z) — локальный по пространству параметр фазового объекта. Из ОРХ и 3D распределения n (x, y, z) можно вычислить различные производные характеристики от этих величин:

— плотность [1];

— концентрацию [1];

— морфометрические характеристики, например, объем, средний радиус, площадь клетки и т. п. [3];

— массу сухих веществ биологической клетки [4]. Devis и Wilkins [5] показали связь между оптической разностью хода света, прошедшего через клетку, и массой ее сухого вещества, a Barer [6,7] - возможность ее измерения с помощью интерференционного микроскопа;

— величину двулучепреломления (ДЛП). Традиционно измеряемый поляризационными методами, показатель ДЛП может быть измерен интерференционно-поляризационным методом. Этот метод выгодно отличается от аналогичных поляризационных методов отсутствием необходимости измерения толщины исследуемого объекта [8,9].

Показатель преломления связан с поляризуемостью белковых структур клетки, следовательно, фазовое изображение несет ценную диагностическую информацию о состоянии биологического микрообъекта. Поэтому с помощью интерференционного микроскопа можно вести мониторинг состояния как отдельной клетки [10−13], так и целой популяции клеток [14]. Это может быть использовано, например, для диагностики состояния системы крови [14].

Корреляция между различными процессами, происходящими в живой клетке, и величиной ОРХ позволяет использовать фазовое изображение также для исследования этих динамических процессов [15, 16].

Количественные исследования характеристик фазовых микрообъектов можно проводить только с помощью интерференционных микроскопов [17]. Только они позволяют измерять ОРХ. Другие способы позволяют лишь визуализировать, либо измерять производную по направлению от ОРХ (DIC). Однако, широкому распространению интерференционных микроскопов препятствовало отсутствие автоматизированных методов расшифровки интерферограмм, что тормозило внедрение данных микроскопов в практику лабораторных исследований и рутинных измерений.

Для проведения измерений в основном используют микроскопы, в основе которых лежат различные схемы двулучевых интерферометров Майкельсона, Маха-Цендера и Миро [17]:

— схема деления пучков Майкельсона используется в микроинтерферометре академика В. П. Линника (1933). Микроскоп Линника позволяет работать с микрообъективами больших числовых апертур. Для исследования фазовых микрообъектов, они должны размещаться на зеркале, расположенном в предметном канале. В этом случае излучение дважды проходит сквозь них (схема на отражение) [17,21].

— схема деления пучков Маха-Цендера используется в микроскопе Хорна (Horn, 1950). В своем составе он имеет две идентичные ветви, в которых располагаются исследуемый препарат и препарат сравнения. Излучение проходит через исследуемый микрообъект один раз (схема на просвет) [17, 5].

— схема деления пучков по Миро используется в микроскопе Дайсона (Dyson, 1950; Pfeiffer, 1954). Пучок сравнения формируется из той части предметного пучка, которая не прошла через исследуемый объект Недостатком этой схемы является значительная потеря света и рассеянный свет, возникающие вследствие многих отражений. Данная схема также предназначена для исследования фазовых микрообъектов на просвет [17].

Одной из тенденций современной интерференционной микроскопии является создание самостоятельных оптических узлов с микрообъективами, реализующих тот или иной вид интерференционной схемы (микрообъектив-интерферометр). Известны такие схемы, реализованные для интерферометров Физо, Миро, Майкельсона и Линника.

Традиционно расшифровка интерферограмм, полученных на таких микроскопах, производилась вручную. Только в последние десятилетия были предложены и освоены алгоритмы автоматической расшифровки интерферограмм, которые впоследствии были применены и в интерференционных микроскопах. Этому способствовало появлением быстрых ПЭВМ, систем захвата и обработки изображений, высоко чувствительных ПЗС-камер.

Впервые автоматизированный вариант интерференционного микроскопа Линника МИИ-4 был разработан профессором В. П. Тычинским (1989) и назван «Эйрискан» [15] [18]. В качестве фотоприемного устройства в этом микроскопе используется диссектор. Изображение объекта получается путем развертки. Для реконструкции фазы реализован компенсационный метод (метод временных интервалов [19]). Значение фазы в выбранной точке пропорционально нормированному временному интервалу между моментами регистрации двух минимальных значений интенсивности на фотоприемнике при сдвиге зеркала опорного канала на половину длины волны излучения (л). Время съема данных прямо пропорционально зависит от числа отсчетов, в которых производятся измерения и составляет 1мс/пиксель. Т. е. за время одного телевизионного кадра (40мс) регистрируется изображение размером 40 пикселей.

Известен также автоматизированный вариант микроскопа Хорна (Zicha и Dunn, 1995) [5]. В этом микроскопе используется метод фазовых шагов [20]. Дискретный фазовый сдвиг обеспечивается поперечным перемещением компенсационного клина, управляемого от шагового двигателя. Данный метод получил название DRIMAPS (digitally recorded interference microscopy with automatic phase shifting — цифровая интерференционная микроскопия с автоматическим фазовым сдвигом). Схема микроскопа Хорна сложна в эксплуатации и настройке, так как требует наличия двух идентичных каналов с одинаково приготовленными препаратами: исследуемого препарата и препарата сравнения.

Среди всех схем наиболее предпочтительна схема интерферометра Линника [21]. Ее преимущества в том, что она позволяет обеспечить:

— высокое пространственное разрешение, вследствие возможности использования микрообъективов большой числовой апертуры;

— повышенную чувствительность в измерении ОРХ из-за двойного.

• прохождения света (схема на отражение).

Отсюда следует, что, несомненно, актуальной является тема разработки и исследования методов интерференционной микроскопии, позволяющих автоматизировать измерения, повысить разрешающую способность и чувствительность, а также сократить время съема данных для измерения ОРХ как статических, так и динамических объектов при большом числе отсчетов.

Для измерения локальных характеристик внутренних неоднородностей микрообъектов разработаны методы конфокальной сканирующей микроскопии [22−24], оптической когерентной микроскопии [25, 26], а также методы, использующие томографическую реконструкцию. В конфокальном микроскопе.

• изображения внутренних сечений формируются за счет сканирования и пространственной фильтрации излучения. Данный метод пригоден лишь для исследования самосветящихся- (флуоресцентных) объектов. Оптическая когерентная микроскопия основана на принципах оптической когерентной томографии и представляет метод оптической локации с использованием низкокогерентного излучения [27]. Изображение сечения получается за счет интерференции света, рассеянного в тонком слое внутри объекта, и опорной волны. Толщина слоя определяется длиной когерентности источника. Метод пригоден для визуализации градиентов показателя преломления сильно рассеивающих фазовых объектов и слоистых структур. Так как в.

• микроинтерферометрии фазовых объектов измеряемым является интегральный параметр — ОРХ, то для реконструкции п (х, у, г) необходимо использовать только принципы томографии [28].

Известен микроскоп, подобный конфокальному, с реконструкцией по томографическим алгоритмам [29]. Вместо точечного детектора использовался матричный фотоприемник, на котором регистрировались суммарные изображения и решалась обратная задача. Недостаток этого метода состоит в необходимости сканирования по всем трем направлениях и регистрации большого объема данных.

Особенность интерференционной вычислительной микротомографии заключается в решении технически сложной задачи встраивания системы сбора проекционных данных в интерференционный микроскоп [30]. Зондирование объекта может осуществлять либо параллельным пучком света либо расходящимся (коническим). В первом случае формируются параллельные проекции, а во втором — конические.

Возможные следующие варианты зондирования:

— поворот пучка зондирующего излучения относительно неподвижного объекта;

— вращение (наклон) объекта относительно неподвижного пучка зондирующего излучения.

Схемы с поворотом пучка относительно неподвижного объекта различаются по траектории, которую описывает зондирующий пучок относительно объекта, или области (сетке), на которой регистрируются проекции. Известны следующие подходы:

— внеосевая вращающаяся точечная диафрагма в плоскости апертурной диафрагмы микрообъектива [31]. Траектория зондирования — окружность;

— одномерное смещение точечного источника в плоскости апертурной диафрагмы конденсора и получение наклонного освещения [32]. Траектория зондирования — прямая (1D);

— использование матрицы микрозеркал DMD (Digital Micromirror Devices), помещенных в апертурной диафрагме микрообъектива, для создания наклонного освещения [33]. Схема может быть использована только для небольших объектов. Траектория зондирования — любая двумерная (2D);

— двумерное смещение точечного источника в плоскости апертурной диафрагмы микрообъектива и получение наклонного освещения [34−36]. Траектория зондирования — любая двумерная (2D).

Среди этих схем наибольшее предпочтение имеют схемы, обеспечивающие двумерную траекторию. Все подходы имеют общий.

• недостаток, заключающийся в том, что угол зондирования объекта ограничен числовой апертурой микрообъектива и не превышает ±45°.

Схемы со сканированием объекта относительно неподвижного пучка (micro-axial tomography) реализованы для следующих вариантов вращения:

— вращение капилляра с находящимся внутри него объектом [37−39];

— наклон объекта, помещенного между двумя покровными стеклами.

Эти схемы обеспечивают большой угол зондирования. Однако для их реализации необходимо, чтобы ось вращения проходила через объект, иначе при вращении он выйдет из области фокусировки. Т. е. необходимо создавать сложные поворотные механизмы, обеспечивающие выравнивание.

• микрообъекта относительно оси вращения.

Таким образом, из всего вышеизложенного следует, что в области интерференционной микроскопии актуальной является также проблема разработки методов оптической микротомографии фазовых объектов, обеспечивающих большой угол зондирования, различные траектории сканирования и большое число проекций.

Цель работы.

Разработка и исследование интерференционных методов измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов на основе оптической микроскопии и микротомографии, позволяющих автоматизировать измерения, повысить разрешающую способность и чувствительность измерений, сократить время съема данных, а также увеличить диапазон углов зондирования и расширить набор траекторий сканирования.

Основные задачи исследования.

1) Исследование принципа формирования изображения в интерференционном микроскопе Линника с широким источником монохроматического пространственно-некогерентного света.

2) Разработка и исследование автоматизированного интерференционного микроскопа. Определение точности измерения ОРХ.

3) Разработка метода вычисления интегральных параметров (массы сухого вещества клетки) по фазовым изображениям, полученным на интерференционном микроскопе.

4) Разработка и исследование схем интерференционных микротомографов:

— на базе микроскопа Линника;

— на базе конфокального микроскопа;

— на базе микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором. Научная новизна.

1) Впервые показано, что интерференционное изображение, формируемое в микроскопе Линника с источником пространственно-некогерентного света, является суммой интерферограмм от каждой пары предметного и опорного пучков, образующихся из одной и той же точки источника. Область локализации такой суммарной интерферограммы контрастная интерференционная картина) наблюдается в ограниченной узкой зоне.

2) Теоретически и экспериментально исследованы факторы, влияющие на случайную погрешность измерения массы сухого вещества клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе.

3) Разработана схема интерференционного томографического микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором, позволяющая получать проекционные данные в полярном угле ±63° и диапазоне азимутального угла 0360° с шагом 10°.

Практическая ценность и использование результатов работы.

Разработанные методики могут быть применены для создания автоматизированных интерференционных микроскопов и интерференционных томографических микроскопов, для автоматизации существующих интерференционных микроскопов. Изложенные методики получения фазовых изображений, измерения интегральных параметров (морфометрических параметров, массы сухих веществ) и динамической фазовой микроскопии реализованы для автоматизированного интерференционного микроскопа Линника (ВНИИОФИ), а также для автоматизированных интерференционных микроскопов Центра Аналитической Микроскопии (Пущино), Московского Областного Научно-Исследовательского Института им. Владимирского (МОНИКИ), кафедры биофизики биофака МГУ им. М. В. Ломоносова и «Научно-исследовательского центра по изучению свойств поверхности и вакуума» («НИЦПВ»).

Апробация работы, публикации.

Основные материалы, представленные в диссертации, были доложены на:

— «Научной сессии МИФИ 2003»;

— 7-ой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», 2003 г.;

— «Научной сессии МИФИ 2004»;

— Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика», 2004 г.;

— 15-ой научно-технической конференции «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», 2005 г.;

— 9-ой международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков», 2005 г.;

— Научно-практической конференции «Голография в России и за рубежом. Наука и практика», 2005 г.

Структура и объем работы.

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 7 тезисов докладов на отечественных научно — технических конференциях, 3 статьи в журналах «Оптика и спектроскопия», «Измерительная техника» и «Microscopy and Analysis» (Англия).

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Изображение, формируемое в микроскопе Линника с пространственно-некогерентным источником света, является суммой интерферограмм волновых полей, исходящих из различных точек источника, поэтому контрастная интерференционная картина наблюдается в плоскости изображения предметного и опорного зеркал.

2) Среднеквадратическая погрешность измерения на автоматизированном интерференционном микроскопе Линника двумерного распределения оптической разности хода излучения, прошедшего через биообъект, составляет не более 1/150 от длины волны зондирующего излучения, что позволяет вычислять массу сухого вещества внутри клетки с относительной погрешностью, не превышающей двух процентов.

3) Освещение коническим пучком объекта с его сканированием в плоскости, перпендикулярной оптической оси микроскопа, и использование матричного фотоприемника, позволяет получать двумерные параллельные проекции объекта. При этом количество проекций равно числу элементов фотоприемника, геометрия их расположения определяет траекторию зондирования, а количество отсчетов в проекции равно числу шагов сканирования.

4) При использовании микрообъектива с числовой апертурой ИА> 1, максимальный угол зондирования объекта, находящегося в среде с показателем преломления пср, равен агС5Ш и, при условии распространения излучения в конденсоре со средой, показатель преломления которой больше, чем ИА.

4.4 Выводы.

Таким образом, для измерения локальных параметров фазовых микрообъектов были разработаны и прошли экспериментальную апробацию микротомографы: «- на основе микроскопа Линника;

— на основе конфокального микроскопа;

— на основе интерферометра с дифракцией на точке с зеркальным иммерсионным конденсором.

Схема микротомографа на основе микроскопа Линника имеет высокую чувствительность измерения ОРХ, объект неподвижен, угол зондирования -90°, траектория зондирования — «квадрат», обеспечивающая минимальную ошибку реконструкции. Однако, при реконструкции по «зеркальным» проекциям объект дополняется своим зеркальным двойником, поэтому необходимо обеспечивать разделение объекта и его отражения, что вносит. дополнительные сложности в оптическую схему.

Микротомограф на основе конфокального микроскопа решает проблему усложнения объекта, так как использует схему «на просвет» с однократным. прохождением излучения. К основным достоинствам схемы относятся: возможность использования фотоприемников с малым числом элементов (матрица ФЭУ), больший угол зондирования — ±50°, траектория зондирования -«квадрат», реализована схема со сканированием объектом, при этом объект не выходит из фокуса, для получения параллельных проекций использован специальный алгоритм. Однако данная схема имеет меньшую чувствительность измерения ОРХ, а особенности зондирования объекта (он располагается между ' двумя покровными стеклами), требует использования иммерсионных объективов с большим рабочим отрезком.

Обе представленные схемы имеют угол зондирования не превышающий ±50°. Для значительного увеличения угла зондирования, был реализован микротомограф с зеркальным иммерсионным конденсором, имеющий максимальный угол зондирования ±63°. Получение фазовых изображений осуществлялось с помощью схемы интерферометра с дифракцией на точке, а реконструкция интерферограмм производилась фурье-методом.

Заключение

.

В процессе выполнения диссертационной работы были получены следующие результаты:

1)Проведен обзор работ по интерференционной микроскопии и интерференционным микроскопам, а также микротомографии. Рассмотрена возможность автоматизации некоторых типов интерференционных микроскопов.

2) Исследован механизм образования контрастной интерференционной картины в микроскопе Линника с широким источником пространственно-некогерентного света и показано, что область ее локализации наблюдается в узкой зоне вблизи плоскости фокусировки предметного и опорного зеркал микроскопа.

3)Рассмотрены факторы, влияющие на погрешность измерения массы, сухого вещества клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе по схеме Линника. Показано, что суммарная среднеквадратическая погрешность вычисления сухого веса клетки не превышает двух процентов.

4) На автоматизированном интерференционном микроскопе Линника проведены эксперименты по измерению следующих интегральных характеристик биообъектов:

— веса сухих веществ эритроцита, среднее значение составило 28 пг, что хорошо согласуется с табличным значениями для сухого веса (27−35 пг);

— изменение инкремента показателя преломления эритроцита во, времени, обнаружена периодичность изменения этой величины со средним периодом 25 минут и амплитудой 5% от среднего значения.

5) Рассмотрен метод получения параллельных томографических проекций в интерференционном микроскопе и показано, что для его осуществления необходимо двумерное сканирование микрообъекта в зоне конического пучка.

6) Разработан макет конфокального томографического микроскопа и проведены эксперименты по получению проекций и реконструкции томограмм для клеток волосков тычиночных нитей традесканции и эритроцитов. Угол зондирования составил ±50°.

7) Рассмотрен метод увеличения угла зондирования микрообъекта в микроскопе и показано, что для этого необходимо использовать иммерсионные объективы (7У/1>1), а зондирующее излучение должно проходить через среду с показателем преломления большим чем ЫА.

8) Разработан макет интерференционного томографического микроскопа с зеркальным иммерсионным конденсором и проведены эксперименты по получению проекций эритроцитов. Для дистиллированной воды в качестве иммерсионной жидкости угол зондирования достигал ±63°.

Таким образом, в настоящей работе решена актуальная научно-техническая задача разработки интерференционных методов измерения интегральных и локальных параметров фазовых микрообъектов, что имеет существенное значение для оптической микроскопии трехмерных фазовых объектов.