Проточная цитофлуориметрия. 
Внутриклеточное содержание белков теплового шока 70 кДа и его взаимосвязь с продукцией активных форм кислорода в нейтрофилах человека при старении

В работе использовали цитофлуориметр FACSСalibur (BD Biosciences, США), укомплектованный двумя лазерами 488 и 640 нм со стандартными детекторами и фильтрами. Нейтрофилы определяли по морфологическим параметрам на диаграмме малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния и по окрашиванию антителами CD14 либо СD66b. Метод проточной цитометрии использовали для оценки в нейтрофилах внутриклеточного уровня HSP70, поверхностной локализации HSP70, внутриклеточной продукции АФК, поверхностной экспрессии маркеров дегрануляции. При каждом цитометрическом измерении анализировали не менее 5000 событий в выделенном регионе. Данные обрабатывали с помощью специализированных программ для обсчета цитометрических данных CellQuest ver. 3.3 (BD Biosciences, США), и FlowJo ver. 7.6.2. (FlowJo, LLC Software, Ashland, США).

Оценка жизнеспособности нейтрофилов

После выделения нейтрофилов клетки окрашивали трипановым синим, доля живых нейтрофилов (не окрашенных реагентом) составляла не менее 95%.

Процентное содержание некрозных и апоптозных клеток в образцах нейтрофилов определяли с использованием ДНК-специфичного флуоресцентного красителя PI. Для определения некрозных (PI-позитивных) нейтрофилов окрашивание образцов, содержащих живые интактные либо подвергнутые гипертермии нейтрофилы после их часовой инкубации, проводили в растворе DPBS, содержащем 2 мкг/мл PI.

Для определения апоптозных клеток образцы фиксировали в охлажденном 70% растворе этанола (60 мин) с последующей двукратной отмывкой, и переводили для измерения в раствор DPBS, содержащий 20 мкг/мл PI и 50 ед./мл РНК-азы А. В каждом образце проводили подсчет не менее 10×103 нейтрофилов в популяции, включающей как живые, так и погибшие клетки. Клетки с пониженным содержанием ДНК оценивали как апоптозные.