Подсчет и замер колоний микроорганизмов

Подсчет колоний микроорганизмов производился с помощью счетчика колоний Flash&Go. Изначально с помощью сопутствующей программы производилась калибровка, а затем анализ каждой чашки с ручной корректировкой.

Замер колоний производился вручную с помощью обыкновенной линейку с ценой деления в 1 мм. Из каждой чашки случайным образом выбиралось 5 колоний, которые затем замерялись с точностью до 0,5 мм.

Методы микроскопического исследования микроорганизмов

Метод раздавленной капли. Данный метод был нами использован для определения подвижности бактерий. На середину чистого предметного стекла мы наносили каплю дистиллированной воды, затем стерильной петлей добавляли небольшое количество бактерий, хорошо размешивая. Сверху каплю накрывали покровным стеклом, предварительно подкрасив ее метиленовым синим. Рассматривали препарат под микроскопом при увеличении 400х. При этом в поле зрения можно было наблюдать подвижные формы микроорганизмов.

Фиксированный препарат. Данный метод мы использовали для определения формы бактериальных клеток. Работу начинали с приготовления мазка, который высушивали над пламенем спиртовки. При этом важно было не допустить перегрева мазка, так как при этом может произойти свертывание белков протоплазмы бактериальной клетки. Затем мы производили фиксирование препарата путем быстрого проведения покровного стекла над пламенем горелки, что обеспечивает лучшее прикрепление мазка к стеклу. После этого — окрашивали препарат раствором карболового фуксина, промывали водопроводной водой, высушивали и рассматривали увеличении 400х.

После фотографии фиксированных препаратов колоний, выращенных при каждой конкретной температуре, подвергались анализу программой ScopeTek, где случайно выбиралось и измерялось по 100 клеток.

Метод окраски по Граму. Данный метод основан на способности клеток микроорганизмов удерживать красители трифенилметанового ряда.

Готовили фиксированный мазок на чистом предметном стекле, сверху помещали полоску фильтровальной бумаги и наносили краситель. Через 1−2 минуты снимали бумагу и, не промывая, наносили на мазок каплю йода. Через 1 мин обесцвечивали мазок спиртом и окрашивали красителем (карболовым фуксином). Затем смывали остатки красителя водой, высушивали над пламенем спиртовки и рассматривали под микроскопом при увеличении 400х. При этом грамположительные бактерии окрашивались в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в розовый.

Метод окраски спор по Цилю-Нильсону в модификации Мюллера. Данный метод был использован для определения возможности некоторых видов загрязнителей к спороношению.

Готовили фиксированный мазок на чистом предметном стекле, затем наносили 5% раствор серной кислоты для протравы. Препарат подогревали пять минут (до появления паров), затем сливали кислоту. После мазок промывали водой, покрывали фильтровальной бумагой и наносили на нее карболовый фуксин Циля. Красили препарат в течение семи минут, периодически добавляя раствор красителя и подогревая его до появления пара или же доводя до кипения. По мере испарения растворителя добавляли краситель, не давая ему подсохнуть во время подогревания. Затем снимали фильтровальную бумагу, препарат промывали и обесцвечивали (в течение 15 сек.) 1% раствором серной кислоты, после чего промывали водой. Потом окрашивали препарат метиленовым синим в течение 1 мин. Затем препарат тщательной промывали водой, высушивали над пламенем спиртовки и рассматривали под микроскопом при увеличении 400х.

Споры при этом приобретали характерный красный цвет, а вегетативные клетки — синий.