Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация)

Гель-проникающая хроматография (ее иногда называют молекулярно-ситовой хроматографией) является методом распределительной хроматографии, так как основана на разделении молекул за счет различия их размеров. Этот метод позволяет разделить белки как по форме, так и по величине. Разделение проводят на хроматографических колонках (рис. 3.6), заполненных сферическими гранулами набухшего геля полимера (размеры гранул геля могут.

Рис. 3.6. Схема гель-фильтрации:

а — на колонку, заполненную декстриновыми гранулами, наносится смесь больших и маленьких белков; б — по мере прохождения вниз по колонке молекулы малого белка проникают в гранулы и задерживаются; в — молекулы более крупного белка первыми выходят из колонки изменяться от 10 до 500 мкм). Гранулы геля имеют внутренние каналы (поры), характеризующиеся определенным средним размером, от которого зависит их проницаемость. Смесь белков при пропускании ее через колонку в зависимости от размеров отдельных белковых молекул пространственно разделяется. Крупные белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля, перемещаются по колонке с высокой скоростью. Средние и мелкие белковые молекулы удерживаются в порах геля в зависимости от размера. В верхней части колонки удерживаются самые мелкие молекулы из-за их высокой способности проникать внутрь частиц геля. При элюировании буферным раствором первыми выходят наиболее крупные молекулы белков. Элюат собирают отдельными фракциями. Чем выше объем элюата, затраченного на выход из колонки определенной фракции белка, тем ниже молекулярная масса белка в данной фракции.

Аффинная хроматография. Данный метод является высокоспецифичным и эффективным для выделения белков. Многие традиционные методы выделения и очистки, используемые в органической химии, такие как возгонка и экстрагирование различными растворителями, не пригодны для большинства белков из-за того, что их молекулы легко разрушаются. Поэтому для выделения и очистки белков разработаны специальные методы, которыми удается выделить какой-нибудь один из белков, присутствующих в смеси, содержащей несколько тысяч других биомолекул, в концентрации КГ⁵…КГ⁶ М. Один из таких методов, метод аффинной хроматографии (рис. 3.7), сыграл решающую роль при выделении и очистке рецепторных белков, ряда ферментов и иммуноглобулинов. В основе метода лежит хорошо известный факт, что белки, выполняя свойственные им биологические функции, обратимо связываются с другими специфическими видами молекул, называемых лигандами. В результате образуются прочные нековалентные белковолигандные комплексы.

Рис. 3.7. Принципиальная схема выделения белков методом аффинной хроматографии.

По этому методу лиганд, специфически связывающийся с белком, который необходимо выделить, ковалентно присоединяется к нерастворимым полимерным гранулам диаметром 10…50 мкм. Для выделения этого белка из клеточного экстракта последний вносят в колонку, заполненную полимерными гранулами с присоединенным к ним лигандом, после чего колонку несколько раз промывают буферным раствором. При этом на колонке удерживаются лишь те белки, которые имеют высокое сродство к закрепленному на полимере лиганду; остальные же просто вымываются буфером. Поскольку сродство и специфичность белка к лиганду очень высоки, зачастую в один прием можно выделить и очистить чрезвычайно малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.