Анализ пролиферативной активности лимфоцитов с использованием набора Кi-67

Клеточную суспензию из бакпечаток переливают в чистые центрифужные пробирки, подписывают. Центрифугируют 7 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Добавляют 200−250 мл Cytofix/Cytoperm, перемешивают и инкубируют 15 минут при температуре +4°С. Центрифугируют 7 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Затем проводят 2-кратную отмывку раствором Perm/Wash. Добавляют 1000 мл охлажденного 70% спирта, хорошо перемешивая, и инкубируют на льду не менее 2 часов.

Окраска Ki-67. Клеточную суспензию по окончании фиксации однократно отмывают раствором BSA или Perm/Wash. Затем снова добавляют 1 мл раствора BSA или Perm/Wash и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость сливают.

Добавляют 100 мкл буфера BSA, перемешивают и переносят по 100 мкл клеточной суспензии в чистые пробирки для проточного цитометра. В первую пробирку добавляют 8 мкл изотипического негативного контроля, во вторую — 8 мкл анти-Ki-67. Инкубируют 40 минут при комнатной температуре в темноте. Затем проводят 2-кратную отмывку раствором BSA или Perm/Wash.

Добавляют 450 мкл PI/RNase, инкубируют 30 минут при комнатной температуре в темноте.