Получение высокоактивного специфического биологического сырья (антигенов и антител) для конструирования диагностических препаратов

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЁЗА

Для получения качественных иммунных сывороток, применяемых при производстве туберкулёзных диагностических препаратов, необходимы ак-тивные антигенные комплексы, используемые при иммунизации. Характер-ным для МТБ является наличие большого количества липидов в цитоплазме. Липиды микобактерий подразделяются на свободные и гликолипиды. Проч-но связанные липиды обуславливают кислотоустойчивость микобактерий, при удалении их из клетки микобактерии теряют возможность вызывать ги-перчувствительность замедленного типа и резистентность к туберкулёзу (Ги-затулина Н.М., 1996). Миколовые кислоты микобактерий характеризуются содержанием значительно большего числа атомов углерода в цепи (С6о-9о), чем у нокардий (С32−60), и при пиролизе освобождают жирные кислоты с числом атомов С22−26. Установлено, что вирулентные виды микобактерий содержат значительное количество фтиеновых кислот и воска фтиоцеролдимико-церозата, что не характерно для нокардоподобных бактерий. Только у мико-бактерий обнаружен необычный тип липополисахарида, состоящий из Д-глюкозы, 6-ометилглюкозы и 3-о-метилглюкозы. На содержание и структуру тех или иных химических компонентов в клетках могут оказывать влияние состав питательной среды, на которой выращивается микроорганизм, и температура его культивирования. Известны данные о том, что содержание фосфолипидов зависит от возраста и условий культивирования МТБ, от ме-тодов, используемых для их обнаружения (Андреев Л.В., 1997).

Нами проведены исследования по подбору эффективных способов извлечения специфических антигенов из бактериальных масс МТБ, обладающих необходимыми физико-химическими и иммунологическими свойствами. Для этого использовали штаммы, представленные в таблице 1.

Водорастворимые туберкулёзные антигены изолировали комплексным методом: последовательно водно-солевой экстракцией, механической и ультразвуковой дезинтеграцией. О степени разрушения микробных клеток судили по изменению оптической плотности, которую регистрировали фотоэлектроколориметрически и по количеству белка в надосадочных жидкостях, полученных центрифугированием при 20 000 g в течение 30 мин, а также микроскопически с помощью биологического микроскопа.

Кроме водно-солевой экстракции нами использован дополнительно ме-тод дезинтеграции в связи с тем, что в основе широко используемых физиче-ских методов дезинтеграции лежит механизм высокоградиентных течений жидкости. Под воздействием ультразвуковых волн наступает разрушение клеток микробов, а изменения в структуре химических веществ, находящихся в них, происходят гораздо медленнее, что обеспечивает возможность получения различных активных комплексов, близких к нативным. Технология получения водорастворимых антигенов:

I стадия. Экстрагирование раствором хлорида натрия и фракционирование сернокислым аммонием.

Бакмассы микобактерий, обеззараженные и высушенные ацетоном, экстрагировали в 5−10 объёмах 2,5% раствора хлорида натрия. После цен-трифугирования при 20 000 g в течение 30 мин супернатант отделяли от осадка. Для фракционирования антигенов в супернатант добавляли сульфат аммония до 80% насыщения и перемешивали на магнитной мешалке в тече-ние 30 мин. Полученный раствор оставляли на 16−18 часов при 4 0С для формирования осадка, после чего смесь центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин, супернатант удаляли, а осадок растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1 и проводили диализ против водо-проводной, а затем дистиллированной воды до отсутствия ионов NH2+, опре-деляемых реактивом Несслера. II стадия. Механическая дезинтеграция Осадок, полученный после центрифугирования бактериальной массы и взвешенный в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1, в объеме 30 мл помещали в камеру Х-пресс дезинтегратора, предварительно охлажденного в течение 2 часов при температуре минус 40 0C. Микробные клетки в дезинтеграторе замораживали при той же температуре в течение 8 часов. После этого проводили разрушение клеток на гидравлическом прессе, четырехкратно продавливая бакмассу через калиброванное отверстие па-трона дезинтегратора. Далее биомассу размораживали и центрифугировали при 20 000 g в течение 30 минут.

III стадия. Ультразвуковая дезинтеграция Осадок, полученный после предыдущей стадии, суспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1, добавляли детергент твин-80 до конечной концентрации 0,1% для улучшения солюбилиза-ции белковых компонентов структур рибосом и мембран клеточных элементов. Твин-80 снижает поверхностное натяжение бактериальной стенки, ограничивает её способность противостоять внутриклеточному давлению, что облегчает разрыв стенки с выходом клеточного содержимого в раствор. Полученную суспензию микробных клеток в объеме 30 мл помещали в дезинтегратор УЗДН-2Т. Используя ультразвуковые колебания различной частоты (22 и 44 кГц), интенсивности и варьируя длительностью воздействия на микобактерии (от 5 до 30 мин) при температуре 0−4 0С, мы получили разный эффект: от слабо выраженных изменений до полного разрушения микробных клеток. Следует учитывать, что при жёстких режимах ультразвукового воздействия в ультраозвученной водной среде вследствие возникновения в кавитационных областях электрического напряжения образуются продукты расщепления ионизированных молекул водысвободные гидроксильные ра-дикалы и атомарный кислород. Эти продукты инициируют деградацию неко-торых биологически активных веществ. В результате было установлено, что наиболее эффективными параметрами являются: время воздействия 20 мин при частоте 22 кГц.

На заключительном этапе приготовления антигенного комплекса все полученные антигенные фракции микобактерий туберкулёза смешивали (рисунок 1).

Выход отдельных антигенов туберкулёзного микроба из 100 мг бак-массы и их специфическая активность представлены в таблице 2. Качество полученных антигенов контролировали измерением концентрации белка на спектрофотометре СФ-26 при длинах волн 260 и 280 нм, в реакции преципитации в геле по О. Оухтерлони с туберкулёзной сывороткой, полученной нами (СтавНИПЧИ).

Как видно из таблицы 2, полученные из МТБ различными методами препараты содержали антигены, выявляемые в РИД.

Использование данного метода позволяет получать наиболее полный антигенный комплекс из бакмасс микобактерий туберкулёза с сохранением активности, снизить потери на стадиях выделения. Активность полученных антигенов в РИД с туберкулёзной иммунной сывороткой составляла 1:321:64 (рисунок 2).

В дальнейшем водорастворимый туберкулёзный антиген использовали для иммунизации животных и в качестве положительного контроля при конструировании диагностических тест-систем.

Таким образом, нами подобран эффективный комплекс последовательных манипуляций, позволяющий изолировать в достаточном количестве полноценные антигенные фракции МТБ при сохранении их нативности.

Известные из данных литературы другие методы получения из МТБ антигенного материала путём ацетоновой и спиртовой экстракции не позволяют получить высокоактивный антигенный комплекс (Драбкина Р. Д. 1963).