Связь перекисного окисления липидов с агрегационной активностью тромбоцитов

Актуальность проблемы. Роль свободнорадикального окисления липидов в развитии многих заболеваний засвидетельствована в ряде работ последних лет [О.А.Азизова и др., 1996; Д. В. Морозов и др., 1996; Е. П. Шувалова и др., 1996; С. Л. Плавинский, А. С. Кузнецов, 1997; Р. М. Сафаров и др. 1997]. Связано это в первую очередь с его значением в гомеостазе вообще [Л.К.Обухова, Н. М. Эмануэль, 1983]. Среди многочисленных заболеваний, для которых характерна интенсификация свободнорадикальных процессов, особый интерес представляют те, при которых одновременно наблюдается активация ПОЛ, как следствие ускоренного образования свободных радикалов, и рост свертываемости крови. Такое сочетание может приводить к развитию ДВС [А.Ш.Бышевский и др., 1995; 1996; Zhen е.а., 1996].

Синхронно обнаруживаемые гиперкоагуляция и активация ПОЛ у больных [Л.В.Шаталина и др., 1996; В. З. Ланкин, 1997] и экспериментальных животных, сдерживание антиоксидантами ге-мокоагуляционных сдвигов при одновременно ускоренном процессе ПОЛ [А.А.Гарганеева и др., 1997; И. Ш. Весельский, A.B.Сонник, 1997] свидетельствует о необходимости детального изучения механизмов взаимосвязи между свободнорадикальными процессами и гемокоагуляцией. Существование такой связи уже не вызывает сомнений, начиная с работ В. П. Мищенко [1981] и ряда последующих [Э.С.Габриелян, С. Э. Акопов, 1985; А. Ш. Бышевский и др., 1991, 1992, С. Л. Галян, 1993; В. Г. Соловьев, 1997]. Механизмы же реализации связи затронуты в единичных сообщениях [В.П.Мищенко, 1981; Borzak е.а. 1998]. Тем не менее, есть сведения о модификации мембранных липидов под влиянием свободнорадикального окисления, о роли фосфолипидов в формировании тромбопластической активности клеток и тканей [В.Г.Соловьев, 1997; И.В.Раль-ченко, 1998; 2уаа1 е.а., 1980].

Так как независимо от триггерного механизма активация свертывания всегда включает тромбинообразование [Б.А.Кудряшов, 1975; Д. М. Зубаиров, 1978], вполне вероятно, что связь между повышением свертывающей активности крови и интенсификацией ПОЛ может реализоваться через изменения уровня тромбина до степени гипертромбинемии [А.Ш.Бышевский, 1996; В. Г. Соловьев, 1997]. В подтверждение такого предположения исследовали механизм влияния тромбинемии на ПОЛ некоторых клеток крови, как образований, активно участвующих в гемостазе [Б.И.Кузник и др., 1989; А. Ш. Бышевский и др., 1996] и реагирующих на тромбин активацией процессов ПОЛ [С.Н.Ельдецова, 1990; И. В. Селиванова, 1994]. Наиболее активно реагирующие на тромбин клетки — тромбоциты, которые располагают специализированными рецепторами к этому белку [Э.С.Габриелян, С. Э. Акопов, 1985; ЛагшеБоп е.а., 1980] и имеют системы, продуцирующие эндоперекиси простагландинов феББ, 1989].

В нашей лаборатории, начиная с 80 гг. изучается связь между ПОЛ и гемостазом. Результаты серии экспериментальных работ позволили сформулировать представление о существовании положительной обратной связи между системой, обеспечивающей ПОЛ, и системой тромбинообразования. В предельно кратком виде это представление выражается схемой «тромбинемия —» активация ПОЛ" и «активация ПОЛ -> тромбинемия» [А.Ш.Бышевский и др., 1989, 1992; С. Л. Галян и др. 1990; С. Н. Ельдецова, 1990; И. В. Селиванова, 1994]. Представление, основанное на экспериментально полученных фактах, получило подтверждение-и в клинических исследованиях [С.Л.Галян, 1993; В. А. Полякова, 1994; Т.П.Шевлюко-ва, 1996]. Есть экспериментальные данные, позволяющие допускать, что тромбоциты — одно из важных звеньев связи «тром-бинемия-ПОЛ» [И.В.Селиванова, 1994; В. Г. Соловьев, 1997]. Вместе с тем, механизмы участия тромбоцитов в обеспечении этой связи не изучены, есть лишь основания (ориентируясь на сведения о роли тромбоцитов в гемостазе и их роли в продукции эндоперокси-дов) считать, что эти клетки могут под действием тромбина высвобождать факторы плазмокоагуляции, активирующие тромбиногенез — фф. Р3 и Р4. [Д.М.Зубаиров, 1978; З. С. Баркаган, 1988; А.Ш.Бы-шевский и др., 1990].

На основании сказанного и принимая во внимание практическую значимость сведений о механизмах связи между свободнора-дикальными процессами и гемостазом, мы сочли целесообразным предпринять исследования для уточнения роли важного компонента гемостаза — тромбоцитов в обеспечении двусторонней зависимости «тромбинемия — ПОЛ».

Цель работы — установить, существует ли зависимость между перекисным окислением липидов в тромбоцитах, их агрегантной активностью и способностью высвобождать факторы свертывания.

Задачи исследования.

1. Экспериментально изучить состояние ПОЛ при экзогенной и эндогенной гипертромбинемии в тромбоцитах, как воздействии, повышающем агрегационные свойства этих клеток;

2. Изучить экспериментально агрегационные свойства тромбоцитов при активации ПОЛ;

3. Изучить экспериментально агрегационные свойства тромбоцитов при торможении ПОЛ;

4. Изучить агрегационную активность тромбоцитов и интенсивность ПОЛ в них при некоторых заболеваниях, характеризующихся ускорением свободнорадикальных процессов и активацией свертывания крови.

5. Изучить экспериментально влияние уровня продуктов ПОЛ в плазме на агрегационную активность тромбоцитов.

Научная новизна.

Впервые показано, что гипертромбинемия, вызываемая введением тромбопластина, усиливающего генерацию тромбина, или введением собственно тромбина в кровоток вызывает активацию ПОЛ в тромбоцитах (рост содержания первичных и вторичных продуктов пероксидации), и снижение антиоксидантного потенциала (укорочение периода индукции и рост скорости окисления). Установлено, что сдвиги интенсивности ПОЛ в тромбоцитах сопровождаются активацией их агрегантных свойств и способности к высвобождению факторов Р3 и Р4.

Впервые установлено, что введение в организм экспериментальных животных прооксиданта повышает интенсивность ПОЛ в тромбоцитах, ускоряет агрегацию и высвобождение фф. Р3 и Р4, а введение в организм животных антиоксидантов ограничивает интенсивность ПОЛ в тромбоцитах, снижает их агрегационную активность и способность к высвобождению фф. Р3 и Р4.

Впервые показано, что при заболеваниях, характеризующихся активацией ПОЛ и свертываемости крови (инсулинзависимый сахарный диабет /ИЗСД/), атеросклеротические поражения артериальных сосудов, гестоз), повышено содержание продуктов пероксидации в тромбоцитах и их способность к агрегации.

Впервые выявлена прямая зависимость (близкая к линейной) между интенсивностью прироста продуктов ПОЛ в тромбоцитах и приростом их агрегационной активности, а также зависимость между концентрацией продуктов пероксидации в окружении тромбоцитов и их агрегационной и «высвобождающей» активностью.

Практическая ценность работы. Материалы исследований использованы при разработке методических рекомендаций по применению комплексного антиоксиданта (препарат селмевит или Вита-комплекс) в лечении больных с атеросклеротическими поражениями артерий нижних конечностей в период подготовки и после операций аорто-бедренного и аорто-подколенного шунтирования артерий — методические рекомендации по применению комплексного антиоксиданта «Селмевит» в лечении больных с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей до и после операции ар-териовенозного шунтирования. Внедрены в ОКБ и Облонкодиспан-сере. Результаты работы использованы при написании монографии «Тромбоциты» (А.Ш.Бышевский и др., Тюмень, 1996), а также при составлении инструкции по клиническому испытанию Витаком-плекса к заявке в Фармакологический Комитет МЗ и МП РФ (препарат под названием Селмевит утвержден для медицинского применения — «Протокол № 10 Фармакологического государственного комитета от 10 сентября 1997 г»).

Апробация и публикация. Основные положения диссертации доложены на 1) Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище — нутрицевтики — и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях». Тюмень, 1995; 2) Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья». Тюмень, 1996, 1997 гг, 3) 9-й Европейской конференции по гемореологии. Сиена, 1995, 4) Конф. Объединения биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии». Уфа, 1998.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 132. страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных приемов и методов исследования,.

6. ВЫВОДЫ.

1. При экспериментальной гипертромбинемии in vivo в тромбоцитах растет содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ, их спонтанная, максимальная АДФ-индуцированная агрегация и ее начальная скорость, а также высвобождение фф. Р3 и Р4.

2.

Введение

прооксиданта животным увеличивает содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ в тромбоцитах, их спонтанную, АДФ-индуцируемую агрегацию, ее начальную скорость и высвобождение фф. Р3 и Р4. При введении антиоксидантов животным уровень продуктов ПОЛ в тромбоцитах, их агрегационная активность, а также высвобождение фф. Р3 и Р4 снижаются.

3. У больных инсулинзависимым сахарным диабетом, у больных с атеросклеротическими нарушениями артерий нижних конечностей и беременных с гестозом (состояния, характеризующиеся гиперкоагулемией) повышено содержание продуктов ПОЛ в тромбоцитах и начальная скорость их агрегации.

4. Интенсивность ПОЛ в тромбоцитах и их активация у больных инсулинзависимым сахарным диабетом ограничиваются введением в комплекс терапевтических мероприятий антиоксиданта.

5. У больных с атеросклеротическими нарушениями артерий нижних конечностей после операции шунтирования сосудов и у беременных с гестозом после родоразрешения интенсивность ПОЛ в тромбоцитах и начальная скорость их агрегации нарастают, назначение антиоксиданта ограничивает эти сдвиги.

— 108.

6. Существует прямая, близкая к линейной, зависимость между содержанием продуктов ПОЛ в тромбоцитах и их окружении с одной стороны, их агрегантной активностью, а также способностью к высвобождению фф. Р3 и Р4 — с другой.

Полученные данные — дополнительное обоснование к применению антиоксидантов для ограничения нарушений гемостаза при ги-перкоагулемиях, характеризующихся гипероксидацией:

1) тромбоциты — важное звено в цепи процессов, обеспечивающих взаимозависимость между свободнорадикальным окислением И состоянием гемостаза: активация ПОЛ в организме -> активация.

ПОЛ и накопление продуктов пероксидации в тромбоцитах -" рост агрегантной активности тромбоцитов и способности к высвобождению фф. Рз и Р4, ускорение тромбиногенеза активация ПОЛ и т. д.

2) согласно такому взгляду природные антиоксиданты могут рассматриваться как физиологическое доступное средство ограничения гемокоагуляционных сдвигов, особенно при одновременном использовании с антикоагулянтами, которые ограничивают процессы в рассмотренной выше цепи событий на уровне тромбиногенеза.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Прямые и косвенные признаки существования двусторонней «связи между ПОЛ и гемостазом [В.П.Мищенко, 1981; А. Ш. Бышевский и др., 1996; 2уаа1 е.а., 1980], данные о свойстве тромбоцитов реагировать на тромбинемию активацией ПОЛ в этих клетках [В.П.Мищенко, 1981; Воггак е.а., 1998], сведения о тромбоцитах, как клетках, имеющих мощную систему синтеза эндопе-роксидов [Э.С.Габриелян, С. Э. Акопов, 1985; С. Н. Ельдецова, 1990; 2Ьеп е.а., 1996] актуализируют изучение зависимости между состоянием ПОЛ в тромбоцитах и их агрегационной активностью. Этот вид активности полифункциональных клеток, какими являются тромбоциты [Н.Н.Петрищев, 1994], — определяющий момент их участия в гемостазе, кроме того, этот вид активности сопряжен со способностью тромбоцитов к реакции высвобождения, в ходе которой в плазме крови растет уровень компонентов, участвующих в коагуляционном гемостазе — фф. Р3, Р4 и другие [Ж.Фермилен, М. Ферстрате, 1984, 1986; В. П. Балуда и др. 1995].

Вышесказанное обосновало необходимость исследований, посвященных изучению зависимости между ПОЛ в тромбоцитах, их агрегантной активностью и способностью высвобождать важнейшие факторы свертывания.

Для достижения цели мы экспериментально изучали ПОЛ в тромбоцитах при воздействиях, повышающих их агрегацию и реакцию высвобождения, воздействиях, активирующих и угнетающих ПОЛ, контролируя состояние ПОЛ в тромбоцитах, их агрегацию и способность к высвобождению прокоагулянтов. Кроме того изучали ПОЛ в тромбоцитах и их активность при некоторых заболеваниях, характеризующихся ускорением свободнорадикальных процессов и активацией свертывания крови.

В заключение изучили экспериментально зависимость агре-гационной активности тромбоцитов и их способности к высвобождению от состояния ПОЛ в окружении клеток.

Представлялось наиболее целесообразным (согласно цели исследований) в первую очередь изучить состояние ПОЛ в тромбоцитах и их активность при воздействиях, несомненно активирующих свертывание.

Введение

животным тромбопластина — активатора тромбино-образования по внешнему механизму [Д.М.Зубаиров, 1978; А. Ш. Бышевский и др., 1993] - приводило к избыточному накоплению продуктов ПОЛ в тромбоцитах, одновременно удлинялся период индукции и увеличивалась скорость окисления. Все этопризнаки интенсификации процессов ПОЛ в клетках со снижением антиоксидантного потенциала. Одновременно выявлялось усиление агрегации и реакции высвобождения.

Решить, какое из названных явлений (активация ПОЛ или тромбоцитов) первично, можно было лишь на том основании, что воздействие (введение тромбопластина) использовано как инициатор тромбинемии, следовательно, тромбинемия сопровождается активацией ПОЛ в тромбоцитах. В этом плане наши данные согласуются с представлением, согласно которому в эксперименте тромбинемия, независимо от ее происхождения, сопровождается ростом активности ПОЛ в плазме и эритроцитах [С.Н.Ельдецова, 1990; С. А. Ральченко, 1992].

Видимо, тромбинемия в нашем случае — причина активации ПОЛ в тромбоцитах. Активация ПОЛ в этих клетках может, судя по некоторым данным [А.А.Вакулин, 1998; Ьпдо е.а., 1980], сопровождаться ростом агрегации и интенсификацией высвобождения.

Не исключалось, однако, что эффект тромбопластина опосредован не через тромбиногенез, а иными путями: например, известно, что тканевой тромбопластин (ф. III плазмокоагуляции) способен катализировать ряд других процессов [А.Ш.Бышевский, Д. М. Зубаиров, О. А. Терсенов, 1993]. Чтобы исключить или подтвердить такую возможность, мы вводили в кровоток тромбин, функция которого — превращения фибриногена и аутоактивация тромбиноге-неза [В.П.Балуда и др., 1995]. Оказалось, что и после введения тромбина в тромбоцитах активируется ПОЛ, причем, в большей степени, чем после введения тромбопластина (рис. 6).

Рис. 6. Степень изменения (ордината, %) уровня диеновых конъ-югатов (ДК), ТБК-активных продуктов, спонтанной агрегации (СА) и ее начальной скорости (Нач. ск.) после введения тромбина (светлые столбики) или тромбопластина (серые столбики) или после кровопотери (черные столбики).

Это исключает предположение, согласно которому тромбопластин активирует тромбоциты в обход своей специфической функции — активации тромбиногенеза. Возможное возражение, допускающее эффект тромбина на тромбоциты через фибринообра-зование, исключен прямыми наблюдениями: в дефибринированной плазме тромбин повышает уровень продуктов ПОЛ в плазме и эритроцитах [С.Н.Ельдецова, 1990; В. Г. Соловьев, 1997].

При воздействии, провоцирующем эндогенную тромбинемию и одновременно гипоксию (кровопотеря), также нашли активацию ПОЛ в тромбоцитах, превосходящую по интенсивности вызванную тромбином. Мы связываем это с одновременным действием двух факторов: эндогенной тромбинемии и гипоксемии, сопутствующим кровопотере. Интересно, что и степень изменения активности тромбоцитов при кровопотере значительнее. На данной стадии анализа это можно принять как признак того, что активация тромбоцитов — следствие активации ПОЛ.

Таким образом, допустимо, что активация тромбоцитов вторична по отношению к активации ПОЛ, как и изменения реакции высвобождения, следовавшие за изменениями агрегации (ее начальная скорость, спонтанная и максимальная АДФ-агрегация).

Следуя логике, определенной задачами исследований, в очередных экспериментах мы модифицировали интенсивность процессов ПОЛ, воздействуя прооксидантом или антиоксидантами.

В качестве прооксиданта выбран свинец, о котором известны важные для нас особенности: введение ацетата свинца в использованной нами дозе активирует ПОЛ наряду с признаками частичной блокады порфиринового обмена и лишь при более длительном введении (или увеличении дозы) вызывает в качестве вторичного сдвига активацию свертывания крови [А.А.Мкртумян, 1994]. В соответствие с задачей, нам и было необходимо вызвать активацию ПОЛ в качестве первичного изменения.

После введения соли свинца (в течение 12 дней) активность процессов ПОЛ в тромбоцитах повысилась в сравнительно небольшой степени, снизился и антиоксидантный потенциал. Одновременно выявились признаки активации тромбоцитов: рост спонтанной и АДФ-индуцированной агрегации, ее начальной скорости, интенсификация высвобождения фф. Р3 и Р4.

По результатам этого эксперимента можно было с большей определенностью полагать, что изменения активности тромбоцитов вторичны: 1) ацетат свинца — прооксидант (блокатор НЭ-групп цис-теиновых ферментов и других белков), 2) ацетат свинца существенно не влияет на тромбинемию [А.А.Мкртумян, 1994; И. А. Дементьева, 1998], 3) невысокой степени сдвига ПОЛ при введении свинца соответствует небольшая степень активации тромбоцитов по данным этого эксперимента (см. табл. 4 на стр. 46).

Располагая на этом этапе наблюдений данными о тромбоцитах от животных в разных экспериментальных ситуациях, следовательно, с разной интенсивностью ПОЛ, при одновременном наличии характеристик, относящихся к агрегации и высвобождению, мы можем сопоставить два параметра: степень ПОЛ и степень активации тромбоцитов.

Рис. 7. Зависимость показателей активности тромбоцитов (ордината) от концентрации в них диеновых конъюгатов (абсцисса). Столбики против каждой концентрации ДК (слева направо): 1-й — спонтанная агрегация, 2-й — АДФ-агрегация, 3-й — начальная скорость агрегации, 4-й — ф. Рз и 5-й — ф. Р4.

На рис. 7 сопоставлены концентрации первичных продуктов ПОЛ со спонтанной и АДФ-индуцированной агрегацией, с интенсивностью высвобождения фф. Р3 и Р4.

Графическое изображение позволяет видеть, что спонтанная и АДФ-агрегация, и в меньшей степени — начальная скорость агрегации увеличиваются по мере роста концентрации ДК. Высвобождение ф. Р3 линейно нарастает с увеличением концентрации ДК, а ф. Р4 — менее выражено, но пропорционально концентрации ДК.

В итоге, активация тромбоцитов растет пропорционально концентрации первичных продуктов ПОЛ в них, поэтому предпочтительнее рассматривать активацию как вторичное явление. В особенности это касается спонтанной агрегации, характеризующей способность клеток образовывать агрегаты в кровотоке, и реакции высвобождения ф. Р3, являющегося тромбоцитарным тромбопла-стином, появление которого ведет к ускорению процессов активации протромбиназы по внутреннему механизму [Д.М.Зубаиров, 1978; А. Ш. Бышевский и др., 1991]. Максимальная АДФ-агрегация меньше зависит от уровня ДК — видимо, изменение скорости агрегации не сопровождается адекватным ростом полноты агрегации.

Аналогичный анализ с использованием в качестве аргумента концентрации вторичных продуктов ПОЛ, выявил, что в принципе рост их содержания сопровождается активацией тромбоцитов, однако, зависимость далека от линейной — есть значительные флюктуации на протяжении кривой.

При введении витаминов-антиоксидантов (витамины А, В, С и Р) обнаруживалось угнетение ПОЛ и рост антиоксидантной активности в тромбоцитах (снижение уровня первичных и вторичных продуктов пероксидации невелико, но достоверно, удлинение периода индукции не подтверждено статистически, снижение скорости окисления также невелико, но достоверно — табл. 5, стр. 48). Этим сдвигам ПОЛ сопутствовали тенденция к ограничению спонтанной агрегации, снижение максимальной АДФ-агрегации при сохранении ее обычной начальной скорости и слабо выраженной тенденции к ограничению реакции высвобождения фф. Р3 и Р4. В совокупности эти данные — дополнительное свидетельство зависимости агрегационных и «высобождающих» свойств тромбоцита от интенсивности ПОЛ.

Наиболее интересны результаты опытов с введением прои антиоксидантов одновременно (свинца и витаминов): антиоксидан-ты, компенсируя изменения ПОЛ, вызываемые прооксидантом, устраняют сдвиги агрегационной активности тромбоцитов, и их способности к высвобождению факторов свертывания.

Рис. 8. Изменения в тромбоцитах (в % относительно контроля) концентрации ДК, спонтанной агрегации, начальной скорости, высвобождения фф. Р3 и Р4 при введении свинца- (светлые столбики), витаминов-антиоксидантов (серые столбики), свинца и витаминов одновременно (черные столбики). Знак * - достоверные отличия.

Это четко видно при графическом анализе наиболее демонстративно изменявшихся показателей ПОЛ и активности тромбоцитов (рис. 8): 1) приросту концентрации ДК при введении свинца соответствует активация тромбоцитов (ускорение спонтанной агрегации, увеличение начальной скорости АДФ-агрегации, усиленное высвобождение тромбоцитарных факторов), 2) снижению концентрации ДК при введении витаминов соответствует тенденция к ограничению активности тромбоцитов (по тем же признакам), 3) отсутствию изменений концентрации ДК при одновременном введении витаминов и свинца не меняются характеристики тромбоцитов.

При повторении эксперимента с заменой комплекса витами-нов-антиоксидантов синтетическим антиоксидантом димефосфоном получены весьма близкие результаты (рис. 9).

Нач.ск.

Рис. 9. Изменения в тромбоцитах (в % относительно контроля) концентрации ДК, спонтанной агрегации, начальной скорости, высвобождения фф. Рз и Р4 при введении свинца (светлые столбики), димефосфона (серые столбики), свинца и димефосфона одновременно (черные столбики). Знак * - достоверные отличия.

На рис. 9 (как и на рис. 8), видно, что введение прооксиданта (свинца) сопровождается ростом концентрации ДК и соответственно повышением агрегационной активности тромбоцитов. При введении димефосфона существенно снизилась концентрация Дк в клетках и соответственно — их активность. При одновременном введении свинца и димефосфона достоверных отличий всех показателей от контроля не наблюдалось. Следовательно, «чистый» антиок-сидант, как и витамины-антиоксиданты, снижая концентрацию в тромбоцитах ДК, одновременно предупредил рост активности тромбоцитов. Можно с еще большей уверенностью говорить о том, что именно сдвиги ПОЛ в тромбоцитах обусловливают изменения их коагуляционной активности.

Известно, что тромбоциты участвуют в гемостазе не только за счет адгезии и агрегации, которые ведут к образованию тромбо-цитарной пробки или к укреплению фибринового сгустка путем превращения его в кровоостанавливающий тромб [Б.А.Кудряшов, 1975; Д. М. Зубаиров, 1978; З. С. Баркаган, 1988]. Есть иные механизмы участия пластинок в гемокоагуляции: 1) высвобождение ф. Рз, ускоряющего реакции, следующие за контактной фазой — взаимодействие фф. IX, VIII, II при участии ф.1У [Д.М.Зубаиров, 1978; Ж. Фермилен, М. Ферстрате, 1984, 1986]- 2) высвобождение ф. Р4, ограничивающего антикоагулянтный эффект гепарина практически на всех этапах ферментативного каскада свертывания [З.С.Баркаган, 1988; А. Ш. Бышевский и др., 1991].

В связи с этим, представленные выше данные могут служить объяснением уже известного эффекта — сдерживание антиоксидан-тами гемокоагуляционных сдвигов при различного рода экспериментальных состояниях, ведущих к тромбинемии. Так, С.А.Ральчен-ко [1992] и С. Л. Галян [1993] показали, что такие воздействия, как гетерогемотрансфузия, травматический токсикоз, каловый перитонит, кровопотеря и другие ведут к гипертромбинемии, достигающей степени ДВС крови. На фоне предварительного насыщения организма животных антиоксидантами в дозах, снижающих уровень продуктов пероксидации в плазме и эритроцитах, интенсивность гемокоагуляционных сдвигов ослабляется и период восстановления исходного состояния гемостаза сокращается. То же обнаружено при операции остеосинтеза (лечение перелома длинных трубчатых костей) в эксперименте и клинике [А.А.Вакулин, 1993].

На основании полученных нами данных можно полагать, что антиоксиданты, ограничивают участие тромбоцитов в активации свертывания, вызываемого тромбинемией: ослабляется агрегация и реакция высвобождения, следовательно, ограничивается интенсивность аутоактивации тромбинообразования по пути «ф. Р3 -» ускорение реакций взаимодействия ф. IX с VIII и ф. VIII с ф. X -" ф. X" и, в меньшей степени, ф. Ха с ф. II (реакция, ведущая к образованию тромбина — ф. На).

При ограничении процессов ПОЛ антиоксидантами снижается и высвобождение ф. Р4 — антигепарина. Его ограниченная продукция — условие более эффективной «работы» гепарина. Следовательно, антиоксиданты через влияние на тромбоциты, способствуют повышению противосвертывающего потенциала крови.

Обнаружив зависимость между содержанием продуктов ПОЛ в тромбоцитах и их активностью при экспериментальной гипертром-бинемии, выявив, что антиоксиданты, снижая ПОЛ в тромбоцитах, уменьшают и их коагулоактивность, мы далее изучили те же характеристики у больных с заболеваниями, сопровождающимися ги-пертромбинемией, обусловливающей повышенную свертывающую активность. В качестве таких состояний использованы патогенетически различные патологические процессы, отобранные для наблюдения по одному признаку — наклонность к гиперкоагулемии: 1) ин-сулинзависимый сахарный диабет, 2) атеросклеротические нарушения артериальных сосудов нижних конечностей и 3) беременность, осложненная гестозом.

У клинически однородной группы больных с ИЗСД нашли заметное повышение концентрации первичных и вторичных продуктов ПОЛ в тромбоцитах. Этому сопутствовало значительное увеличение спонтанной агрегации и начальной скорости АДФ-агрегации при небольшом снижении показателя максимальной АДФ-агрегации и высоком показателе реакции высвобождения фф Рз и Р4. В совокупности эти данные согласовываются с полученными нами в условиях эксперимента, особенно, если принять во внимание, что экспериментальная гипертромбинемия сопровождается признаками развития ДВС крови [В.Г.Соловьев, 1997], а у наших больных с ИЗСД также наблюдались четкие признаки гипер-коагулемии — прирост продуктов деградации фибриногена, растворимых комплексов фибриногена и рассогласованность показателей общей свертывающей активности [А.А.Нелаева, 1997]. Единственный противоречивый, на первый взгляд, момент — у больных снижен показатель максимальной АДФ-агрегации, в то время как у экспериментальных животных он повышался.

Мы склонны объяснять это расхождение следующим образом. Экспериментальные животные исследовались в условиях остро возникающей тромбинемии — отбор проб через 1 ч после воздействия (введение тромбопластина или тромбина внутривенно) или на 13-й день ежедневного введения прооксиданта. В этих экспериментах тромбоциты непродолжительное время находились в состоянии повышенной активности и прирост спонтанной активации составлял от 42 (введение свинца) до 138 (введение тромбина). У больных ИЗСД прирост спонтанной активации составил 156% по сравнению со здоровыми донорами. Видимо, это и обусловило снижение максимальной агрегации у больных: начальная скорость агрегации у них выше, чем у доноров, а максимум прироста светопро-пускания — показателя, по которому учитывается максимальная агрегация — ниже, поскольку число участвующих в агрегации тромбоцитов упало в связи с высокой спонтанной агрегацией.

Связывать этот эффект с уменьшением числа тромбоцитов на единицу объема крови нет оснований: 1) их количество у больных ИЗСД существенно не менялось [А.А.Нелаева, 1997], 2) даже при снижении общего числа тромбоцитов в 2 раза максимальная агрегация заметно не меняется [В.Г.Соловьев, 1997]. Более того, максимальная агрегация и не может меняться в зависимости от концентрации тромбоцитов, поскольку прирост светопропускания учитывается по отношению к его исходному значению в тестируемой плазме. Остается только одна возможность объяснить этот эффект — длительное нахождение тромбоцитов (продолжительность заболевания у обследуемых — преимущественно от 2 до 10 леттабл. 7, стр. 54) в состоянии повышенной активности привело к появлению клеток, потерявших способность к агрегации (рефрактерные клетки). Такому объяснению отчасти противоречит то, что в эксперименте с кровопотерей, где вследствие одновременного действия двух факторов (тромбинемия и гипоксемия) наблюдается наиболее значительный прирост и спонтанной, и максимальной агрегации. Однако напомним, что определения осуществляли всего через 30 мин после крововзятия, когда еще не успело «истощиться» достаточное число тромбоцитов.

В пользу высказанного предположения свидетельствует и тот факт, что при компенсации нарушений углеводного обмена обычными для таких состояний лечебными мероприятиями степень снижения максимальной агрегации уменьшается. Показано также, что применение антиоксидантов у больных ИЗСД ограничивает клинические проявления заболевания [А.А.Нелаева, 1997].

У больных с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей с признаками ишемии (состояние также сопровождающемся гиперкоагулемией [К.В.Горбатиков, 1998; Ек е1 а1., 1991]) мы нашли повышенное содержание продуктов ПОЛ в тромбоцитах и увеличение начальной скорости агрегации. Степень сдвигов тем выше, чем выраженнее ишемия. Как и у больных с ИЗСД, максимальная АДФ-агрегация оказалась несколько уменьшенной (к сожалению, спонтанную агрегацию у этих больных мы не имели возможности определять).

После операции (аорто-бедренный или бедренно-подколенный шунт), являющейся и стресс-воздействием, и фактором, обусловливающим поступление в кровоток фрагментов клеточных мембран с тромбопластической свойствами [А.Ш.Бышевский, Д.М.Зу-баиров, О. А. Терсенов, 1993], свертывание активировалось до степени ДВС переходной стадии [К.В.Горбатиков, 1998]. В этих условиях мы находили рост содержания продуктов ПОЛ в тромбоцитах и начальной скорости их агрегации. Изменения были более заметными при глубокой исходной ишемии. У больных с ишемией 2Б степени к моменту выписки изменения существенно сгладились, а при ишемии 3−4 степени сохранялись до конца наблюдений.

График динамики ДК и начальной скорости АДФ-агрегации после операции в зависимости от степени ишемии позволяет констатировать (рис. 10), что при ишемии 3−4 степени уровень ДК в тромбоцитах выше исходного весь послеоперационный период, как и начальная скорость АДФ-агрегации.

1−2 сут 7−8 сут 14−21 сут.

Рис. 10. Степень изменения содержания ДК (исчерченные столбики при ишемии 3−4, черные — при ишемии 2Б) и начальной скорости агрегации (серые столбики при ишемии 3−4, белые — при ишемии 2Б) после операции (в % относительно показателей перед операцией).

Аналогичная группа больных, которые в отличие от рассмотренных выше, получала дополнительно к обычной терапии еще и антиоксидант (препарат Витакомплекс), заметно отличалась в послеоперационном по динамике изменения ДК и начальной скорости АДФ-агрегации (рис. 11).

Здесь видно, что уровень ДК в тромбоцитах падает относительно исходного (обнаруженного перед оперативным вмешательством) в степени, пропорциональной продолжительности введения антиоксиданта, параллельно снижается и начальная скорость АДФ-индуцируемой агрегации.

1−2 сут 7−8 сут 14−21 сут.

Рис. 11. Степень изменения содержания ДК (исчерченные столбики при ишемии 3−4, черные при ишемии 2Б) и начальной скорости агрегации (серые столбики при ишемии 3−4, белые — при ишемии 2Б) после операции (в % относительно показателей перед операцией) у больных, получавших антиоксидант (Витакомплекс).

Анализ рассмотренных изменений позволяет утверждать следующее:

1. При атеросклеротическом поражении сосудов нижних конечностей, заболевании, в ходе которого нарушения липидного обмена и гипоксемия [К.В.Горбатиков, 1998; Оа^еи-Штаг а1., 1990; ЕНпёег, «Уа11с1ш5, 1994] обусловливают активацию ПОЛ, наряду с избыточным накоплением продуктов ПОЛ в тромбоцитах растет начальная скорость АДФ-агрегации при одновременном снижении максимальной АДФ-агрегации.

2. После экстремального воздействия (оперативное вмешательство) в тромбоцитах эти отклонения усугубляются пропорционально степени исходной ишемии у больных.

3.

Введение

комплексного антиоксиданта" ограничивает и снижает уровень ДК против значения в предоперационном периоде и даже против значения у доноров. Одновременно сокращается период восстановления начальной скорости агрегации тромбоцитов и их максимальной агрегации к состоянию перед операцией.

4. Совокупность данных указывает на зависимость между ПОЛ в тромбоцитах и их агрегацией при заболевании, в патогенезе которого существенную роль играет активация ПОЛ и которое сопровождается активацией свертываемости крови — гиперкоагулемией.

Обратимся к еще одной патологии — осложненной гестозом беременности. Изучение ПОЛ и агрегации в тромбоцитах у этих женщин информативно в свете наших задач потому, что, во-первых, в предродовом периоде наблюдается той или иной степени гиперкоа-гулемия, усиливающаяся после родов [Bauer, 1995; Wangala е.а., 1995], во-вторых, потому, что гестоз интенсифицирует гемокоагу-ляционные сдвиги настолько, что уже в предродовом периоде наблюдаются признаки начальной стадии ДВС [Ю.И.Цирук, 1998; De Luca Brunori е. а., 1988], усугубляющиеся после родоразрешения и даже приводящие к гибели [Х.Д.Айрекат, 1996; Dombrowski е. а., 1995], и, в-третьих, роды из-за спазма сосудов и нарушения микроциркуляции, особенно при гестозе [Д.Д.Зербино, Л. Л. Лукасевич, 1989; Э. Д. Загородняя, 1996; Redman, Roberts, 1993], а также из-за снижения эндогенного антиоксидантного потенциала [В.В.Абрам-ченко и др., 1995; Пока, 1994] ведут к активации процессов ПОЛ [А.Г.Разбойникова, 1992; Н. И. Размахина, Л. С. Александров, 1994].

У здоровых беременных мы не нашли заметных изменений концентрации продуктов ПОЛ и агрегационной активности тромбоцитов — имела место лишь тенденция к ускорению этих процессов. Через 1−3 сут после родов повысился уровень ДК и ТБК-активных продуктов в тромбоцитах и увеличилась начальная скорость АДФагрегации и, в меньшей степени, — максимальной агрегации. Повышение сохранялось и на 4−7 сут. У беременных с гестозом эти явления выражены заметнее, особенно в послеродовом периоде. Назначение антиоксиданта в предродовом периоде и после родов ограничило эти изменения и сократило время их исчезновения. Естественно, уровень продуктов ПОЛ в тромбоцитах при введении антиоксиданта снижался ниже его значений у женщин-доноров.

Здесь уместно напомнить, что у больных с атеросклеротиче-скими поражениями артерий нижних конечностей и у больных с ИЗСД, наряду с интенсификацией ПОЛ в тромбоцитах и повышением начальной скорости их АДФ-агрегации, сниженной оказывался максимальный уровень АДФ-агрегации. Мы объясняли это, будто бы, парадоксальное явление тем, что при продолжительно протекающем патологическом процессе длительное пребывание тромбоцитов в состоянии активации ведет к появлению рефрактерных или, корректнее, «истощенных» клеток. То, что в послеродовом периоде не было спада максимальной агрегации, а, напротив, наклонность к ее повышению, подтверждает высказанное соображение: продолжительность родов и послеродового периода не сопоставима с продолжительностью атеросклеротического процесса или сахарного диабета у наблюдавшихся нами больных: у родильниц истощения тромбоцитов при сравнительно небольшой активации и кратковременности реакции напряжения истощение не наступало.

Сопоставление данных, полученных в экспериментах с первичной гипертромбинемией, первичной гипероксидацией и одновременным введением прои антиоксидантов, указывает на несомненную связь между состоянием ПОЛ и активацией тромбоцитов. Отставание сдвигов агрегационной и «высвобождающей» активности тромбоцитов от сдвигов ПОЛ в них, способность антиоксидантов ослаблять сдвиги активности тромбоцитов, в том числе и в условиях одновременного введения прооксиданта или прокоагулянта (тромбина, тромбопластина), — указание на. первичность сдвигов ПОЛ в паре «ПОЛ тромбоцитов-активность тромбоцитов». Это допущение подтверждается и наличием прямой зависимости между концентрацией ДК в тромбоцитах, их агрегационной активностью и способностью высвобождать фф. Р3 и Р4. Однако лишь опыты in vitro могли явиться основанием для более категоричного суждения о приоритетности изменений ПОЛ или коагуляционной активности тромбоцитов, и, следовательно, о месте тромбоцитов в связи «ПОЛ-гемостаз», доказанной многочисленными исследованиями [В.П.Мищенко, 1981; А. А. Мкртумян, 1994; С. Л. Галян, 1993; И.В.Раль-ченко, 1998]. Прежде всего мы проанализировали зависимость агрегации от ПОЛ, используя все полученные нами в экспериментах и у больных данные об уровне первичных и вторичных продуктов пероксидации с одной стороны, и начальной скорости агрегации (величина, стабильно повышавшаяся с ростом ПОЛ) тромбоцитовс другой. При этом выяснилось что с ростом концентрации ДК в тромбоцитах начальная скорость их агрегации растет пропорционально и график зависимости приближается к линейному (рис. 3, стр. 75). Зависимость между концентрацией вторичных продуктов ПОЛ (ТБК-активных) и начальной скоростью не может быть оценена однозначно, хотя отчасти пропорциональность выявляется. Это вынуждает нас выяснить, есть ли согласованность между изменениями концентрации первичных и вторичных продуктов ПОЛ в тромбоцитах.

Анализируя по данным таблиц 23 и 24 (стр. 74 и 76) эту зависимость, мы получили графики, представленные ниже.

На рис. 12 видно, что по мере нарастания концентрации ДК в тромбоцитах концентрация вторичных продуктов ПОЛ (ТБК-актив-ных) в среднем возрастает, однако, отдельные участки кривой концентрации ТБК (кривая М) отличаются высокой степенью флюк-туаций. Следовательно, строгой зависимости между содержанием первичных и вторичных продуктов ПОЛ в тромбоцитах при разных экспериментальных ситуациях и патологических состояниях не выявлено. Поэтому ожидать строгой зависимости скорости агрегации от концентрации ТБК-активных продуктов ПОЛ не приходится, т.к. скорость агрегации линейно зависит от концентрации диеновых конъюгатов.

Рис. 12. График зависимости концентрации ТБК-активных продуктов в тромбоцитах от концентрации ДК в них. М — усредненная кривая концентраций ТБК.

Вместе с тем, направленность изменений средней концентрации ТБК-активных продуктов от концентрации диеновых конъюгатов такова: концентрация первых растет вслед за ростом концентрации вторых. Следовательно, можно говорить и о зависимости начальной скорости агрегации от тех и других продуктов ПОЛ, с той разницей, что от уровня диеновых конъюгатов скорость агрегации зависит практически линейно — видимо, они и являются фактором, определяющим готовность тромбоцитов к агрегации.

Заключая исследования, мы попытались в прямом эксперименте изучить зависимость начальной скорости агрегации и интенсивности высвобождения фф. Р3 и Р4 от концентрации продуктов ПОЛ, используя как источник продуктов ПОЛ бесклеточную плазму с разным их содержанием. Получив плазму с разной концентрацией продуктов ПОЛ у крыс, которым предварительно вводили про-оксидант или антиоксидант в неодинаковых дозах, инкубировали ее с субстратной, используемой для определения агрегации.

Анализ полученных данных подтвердил, что начальная скорость агрегации зависит от концентрации ДК и ТБК (рис. 13).

В данном случае концентрация продуктов ПОЛ менялась в ситуациях, создаваемых введением проили антиоксиданта, видимо, поэтому зависимость между концентрацией первичных и вторичных продуктов ПОЛ выразительнее, как и зависимость начальной скорости агрегации от концентрации каждого из этих продуктов.

Следовательно, если концентрация первичных и вторичных продуктов ПОЛ изменяется согласованно, зависимость начальной скорости агрегации от концентрации этих продуктов порознь приближается к линейной в обоих случаях.

Изменения ПОЛ в тромбоцитах при разных экспериментальных или клинических ситуациях сопровождаются однонаправленными, но не согласованными количественно сдвигами концентрации первичных и вторичных продуктов пероксидации.

120 100 80 60 40 20 0.

Рис. 13. График начальной скорости агрегации при разных концентрациях ДК и ТБК.

Видимо, предпочтительнее в таких исследованиях учитывать зависимость начальной скорости агрегации от концентрации ДК.

Это подтвердилось экспериментально при использовании разных разведений плазмы с высокой концентрацией продуктов ПОЛ (в этом случае концентрации ДК и ТБК изменяются в одинаковой степени). Оценив влияние разных разведений плазмы на начальную скорость агрегации тромбоцитов, построили график зависимости начальной скорости агрегации тромбоцитов от концентрации ДК. Этот анализ выявил пропорциональность изменений в данном случае и график зависимости оказался близким к линейному (рис. 5, стр. 80).

В заключение проведем анализ зависимости интенсивности высвобождения фф. Рз и Р4 от концентрации ДК. Напомним, что в этом эксперименте использованы разные концентрации ДК, полученные путем разведения исходной (следовательно, и концентрация ТБК-активных продуктов изменялась пропорционально).

Представленные ниже (рис. 14) графики свидетельствуют о том, что при увеличении концентрации ДК в среде преинкубации тромбоцитов, интенсивность высвобождения фф. Р3 и Р4 растет. Прирост характеризуется линейной зависимостью, но не является пропорциональным: с увеличением концентрации ДК от минималь.

— mol.

ДК.

— ТБК.

— Нач ск. ной до максимально исследованной (в 6,28 раза) высвобождение ф. Р3 и ф. Р4 увеличилось только в 1,67 раза каждого.

Рис. 14. Изменения степени высвобождения фф. Р3 и Р4 в зависимости от концентрации ДК в тромбоцитах.

В конечном счете, и начальная скорость агрегации, и интенсивность высвобождения фф. Р3 и Р4 повышаются при увеличении концентрации ДК в среде. Однако зависимость агрегации от уровня ДК более тесная, чем зависимость реакции высвобождения. Связано это, видимо, с тем, что реакция высвобождения определяется концентрацией продуктов ПОЛ не непосредственно, а через скорость агрегации, с интенсивностью которой она находится в сложной связи [Snyder е.а., 1989].

К сожалению, нет возможности сопоставить полученные нами данные с имеющимися в литературе — мы не встретили аналогичных работ. Однако известны близкие по характеру исследования, цель которых — выяснить, влияет ли интенсивность ПОЛ в организме на проагрегантную способность эритроцитов и лейкоцитов [А.А.Вакулин, 1998]. Исследователь нашел, что, чем выше интенсивность ПОЛ в организме донатора клеток, тем выше проагре-гантный эффект клеток. Показано также, что эритроциты и некоторые фракции лейкоцитов реализуют проагрегационные свойства через высвобождаемые ими продукты ПОЛ [И.В.Ральченко, 1998]. Это косвенно подтверждает установленную нами зависимость агрегационной способности тромбоцитов от уровня продуктов ПОЛ.

• ¦

Заключая обсуждение результатов нашей работы, обратим внимание на главные моменты.

Активация ПОЛ в тромбоцитах при разнообразных экспериментальных ситуациях (гипертромбинемия экзогенная или эндогенная) сопровождается повышением агрегационной активности тромбоцитов, проявляющимся ростом спонтанной агрегации, начальной скорости и максимального значения АДФ-индуцируемой агрегации, а также интенсификацией высвобождения фф. Р3 и Р4.

Интенсификация ПОЛ при введении животным прооксиданта повышает содержание продуктов пероксидации в тромбоцитах, что также сопровождается ростом спонтанной агрегации, начальной скорости и максимального уровня АДФ-индуцируемой агрегации, а также усиленным высвобождением фф. Р3 и Р4.

Угнетение процессов ПОЛ у животных введением антиокси-дантов сопровождается снижением содержания продуктов пероксидации в тромбоцитах, снижением их агрегационной активности и замедлением реакции высвобождения. При одновременном введении прои антиоксиданта сдвиги в тромбоцитах, возникающие при их введении порознь, не обнаруживаются.

При неосложненном ИЗСД и атеросклеротических поражениях артерий нижних конечностей — заболеваниях, на течении которых сказывается состояние гемостаза (в том числе и его тромбоцитар-ного звена), как патогенетического фактора или как фактора, осложняющего течение основного патологического процесса, — наблюдается повышенное содержание продуктов ПОЛ в тромбоцитах, увеличение начальной скорости АДФ-агрегации при ограничении максимально достижимого уровня агрегации.

При беременности, осложненной гестозом, аналогичные изменения в тромбоцитах сопровождаются, однако, ростом максимального уровня АДФ-агрегации.

После стресс-воздействия (операция шунтирования артерий, родоразрешение) наблюдается дополнительный прирост содержания продуктов ПОЛ в тромбоцитах и усугубление описанных изменений их активности.

Назначение всем упомянутым больным комплексного антиок-сиданта (Витакомплекса) на фоне обычных терапевтических мероприятий ограничивает изменения концентрации продуктов ПОЛ в Тромбоцитах и их активности.

Полученные данные в совокупности со сведениями о роли тромбоцитов в гемостазе [Ж.Фермилен, М. Ферстрате, 1984, 1986; Д. М. Зубаиров, 1978; З. С. Баркаган, 1988; В. П. Балуда и др. 1995] позволяют полагать, что этим клеткам принадлежит важное место в реализации описанной ранее [В.П.Мищенко, 1981; А.Ш.Бышевс-кий, 1994] связи между свободнорадикальными процесса и гемо-коагуляцией. Это подтверждает предположения И. В. Селивановой [1994], высказанные на основании наблюдений, согласно которым тромбоциты реагируют на тромбин активацией ПОЛ.

Выполненные нами в последней части работы экспериментыпрямое свидетельство существования связи ПОЛ-тромбоциты, связи, поддающейся количественной оценке.

Таким образом, тромбоциты — звено цепи, соединяющей сво-боднорадикальные процессы и гемокоагуляцию. Их роль заключает.

— 106ся в том, что эти клетки реагируют на изменения концентрации продуктов ПОЛ в них и в окружении усилением своих гемостати-ческих функций (агрегация и реакция высвобождения прокоагу-лянтов). Согласно недавно полученным данным [А.А.Вакулин, 1998; И. А. Дементьева, 1998; И. В. Ральченко, 1998], тромбоциты, возможно, являются звеном, соединяющим в связке «ПОЛ-гемостаз» эффекты эритроцитов и некоторых популяций лейкоцитовклеток, способных интенсифицировать агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов через выделяемые в среду продукты ПОЛ.

Велика вероятность того, что неоднократно установленный позитивный эффект антиоксидантов в предупреждении и ограничении тромбогеморрагий при оперативных вмешательствах [А.А.Вакулин, 1994; В. А. Полякова, 1994; Т. П. Шевлюкова, 1996] реализуется, наряду с другими путями, через ограничение активности тромбоци-тарного компонента гемостаза.