ΠΠ·ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΌΠ΅Ρ
Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌΠΎΠ² ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π³Π΅Π½Π΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ ΠΈΠ½ΡΠΎΡΠΌΠ°ΡΠΈΠΈ ΡΠ²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΎΠ΄Π½ΠΈΠΌ ΠΈΠ· Π½Π°ΠΈΠ±ΠΎΠ»Π΅Π΅ Π°ΠΊΡΡΠ°Π»ΡΠ½ΡΡ
Π½Π°ΠΏΡΠ°Π²Π»Π΅Π½ΠΈΠΉ Π² ΡΠΎΠ²ΡΠ΅ΠΌΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ»ΡΡΠ½ΠΎΠΉ Π±ΠΈΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΠΈ. ΠΠ°ΡΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠΎΠ² ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ ΠΏΡΠΈΠ²ΠΎΠ΄ΡΡ ΠΊ ΡΠ½ΠΈΠΆΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΆΠΈΠ·Π½Π΅ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±Π½ΠΎΡΡΠΈ (Π±ΠΎΠ»Π΅Π·Π½ΡΠΌ) ΠΈΠ»ΠΈ Π»Π΅ΡΠ°Π»ΡΠ½Ρ. ΠΠΎ Π΄Π°Π½Π½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΌΠ°ΡΠΈΠΊΠ΅ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΡΡΡΡ ΡΠΈΡΠΎΠΊΠΈΠ΅ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ Π² ΠΌΠΈΡΠΎΠ²ΡΡ
Π½Π°ΡΡΠ½ΡΡ
ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°Ρ
. ΠΠ΅ΡΠ²ΡΠΉ ΡΡΠ°ΠΏ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π³Π΅Π½ΠΎΠ², ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΡ, ΠΎΡΡΡΠ΅ΡΡΠ²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΠΠ-Π·Π°Π²ΠΈΡΠΈΠΌΡΠΌΠΈ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Π°ΠΌΠΈ (Π ΠΠΠ), ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠ΅ ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΡΡΡ Ρ Π²ΡΠ΅Ρ
ΠΈΠ·Π²Π΅ΡΡΠ½ΡΡ
ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΡΡ
ΠΎΡΠ³Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌΠΎΠ² ΠΈ ΠΌΠ½ΠΎΠ³ΠΈΡ
Π²ΠΈΡΡΡΠΎΠ². ΠΠ±ΡΠ΅ΠΏΡΠΈΠ½ΡΡΠΎ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»ΡΡΡ Π ΠΠΠ Π½Π° Π΄Π²Π΅ Π³ΡΡΠΏΠΏΡ: ΠΌΠ½ΠΎΠ³ΠΎΡΡΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡΠ½ΡΠ΅ ΠΈ ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΡΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡΠ½ΡΠ΅. Π‘Π»ΠΎΠΆΠ½ΡΠ΅ ΠΌΠ½ΠΎΠ³ΠΎΡΡΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡΠ½ΡΠ΅ Π ΠΠΠ Ρ
Π°ΡΠ°ΠΊΡΠ΅ΡΠ½Ρ Π΄Π»Ρ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΡΡ
ΠΎΡΠ³Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌΠΎΠ², ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΡΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡΠ½ΡΠ΅ ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡΡΡΡ Π³Π΅Π½ΠΎΠΌΠ°ΠΌΠΈ Π½Π΅ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΡ
Π²ΠΈΡΡΡΠΎΠ² ΠΈ Π±Π°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠΎΡΠ°Π³ΠΎΠ². ΠΠ°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠΎΡΠ°Π³ Π’7 Escherichia coli ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡΡΠ΅Ρ ΡΠΎΠ±ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΡ Π ΠΠΠ Π΄Π»Ρ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ ΡΡΠ΅Π΄Π½ΠΈΡ
ΠΈ ΠΏΠΎΠ·Π΄Π½ΠΈΡ
Π³Π΅Π½ΠΎΠ². ΠΡΠΎΡ Π±Π΅Π»ΠΎΠΊ, ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ»ΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΌΠ°ΡΡΠΎΠΉ 98 ΠΊΠΠ°, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠΈΡ ΠΎΠ΄Π½Ρ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΏΠ΅ΠΏΡΠΈΠ΄Π½ΡΡ ΡΠ΅ΠΏΡ, Π² ΠΎΡΠ»ΠΈΡΠΈΠ΅ ΠΎΡ ΠΌΡΠ»ΡΡΠΈΡΡΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡΠ½ΡΡ
ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΡΡ
ΠΎΡΠ³Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌΠΎΠ². Π ΡΠΎ ΠΆΠ΅ Π²ΡΠ΅ΠΌΡ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Π° ΡΠ°Π³Π° Π’7 ΠΎΠ±Π»Π°Π΄Π°Π΅Ρ Π²ΡΠ΅ΠΌΠΈ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΡΠΌΠΈ, Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΡΠΌΠΈ Π΄Π»Ρ ΠΏΠΎΠ»Π½ΠΎΡΠ΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅Π·Π° Π ΠΠ (Sousa, 1996; McAllister, 1997). Π‘ΠΎΠ²ΠΏΠ°Π΄Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΡΠ°ΠΏΠΎΠ² ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΈ, ΡΡ
ΠΎΠ΄ΡΡΠ²ΠΎ ΠΎΡΠ³Π°Π½ΠΈΠ·Π°ΡΠΈΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ
ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ»Π΅ΠΊΡΠΎΠ² ΠΈ Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΠ΅ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π°Π»ΡΠ½ΠΎ Π³ΠΎΠΌΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΡΠ½ΡΡ
ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² Π² ΡΡΡΡΠΊΡΡΡΠ°Ρ
Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π· Ρ Π²ΡΠ΅Ρ
ΠΎΡΠ³Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌΠΎΠ² ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΡΡΡ Π³ΠΎΠ²ΠΎΡΠΈΡΡ ΠΎ Π΅Π΄ΠΈΠ½ΠΎΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΠΈΠΈ ΠΌΠ΅Ρ
Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌΠ° ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΈ Π² ΠΏΡΠΈΡΠΎΠ΄Π΅. Π£Π½ΠΈΠ²Π΅ΡΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π°ΠΏΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠ° Π½Π°ΡΡΠ΄Ρ Ρ ΠΎΡΠ½ΠΎΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ ΠΏΡΠΎΡΡΡΠΌ ΡΡΡΡΠΎΠΉΡΡΠ²ΠΎΠΌ ΡΠ°Π³ΠΎΠ²ΡΡ
Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π· ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΠΈΠ»ΠΈ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΡ ΡΠ°Π³Π° Π’7 Π·Π°Π½ΡΡΡ ΡΠ½ΠΈΠΊΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠ΅ ΠΌΠ΅ΡΡΠΎ ΡΡΠ΅Π΄ΠΈ ΠΊΠ»Π°ΡΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΡ
ΠΌΠΎΠ΄Π΅Π»Π΅ΠΉ Π΄Π»Ρ ΠΈΠ·ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΈ. Π’Π°ΠΌ, Π³Π΄Π΅ ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΡ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΉ ΠΌΠ½ΠΎΠ³ΠΎΡΡΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡΠ½ΡΡ
ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π· ΠΎΠΊΠ°Π·ΡΠ²Π°ΡΡΡΡ ΡΡΡΠ΄Π½ΠΎΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠΏΡΠ΅ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡΠΌΠΈ, ΠΈΠ·ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ Π’7 Π ΠΠΠ ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΡΠ΅Ρ Π²ΡΡΠ²ΠΈΡΡ ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π½ΡΠ΅ Π΄Π΅ΡΠ°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΠΊΠ°Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΈΠΊΠ»Π° ΠΈ ΠΏΠΎΠ½ΡΡΡ ΠΏΡΠΈΠ½ΡΠΈΠΏΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΌΠ΅Ρ
Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌΠ° Π² ΡΠ΅Π»ΠΎΠΌ. Π ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΌ ΡΠΈΠΊΠ»Π΅ ΡΠ°Π·Π»ΠΈΡΠ°ΡΡ ΡΡΠΈ ΡΡΠ°Π΄ΠΈΠΈ: ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΈΡ, ΡΠ»ΠΎΠ½Π³Π°ΡΠΈΡ ΠΈ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΡ. ΠΠ° ΠΏΠ΅ΡΠ²ΠΎΠΉ ΡΡΠ°Π΄ΠΈΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΈ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Π° ΡΠ·Π½Π°ΡΡ ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΡΡ I. jt. Π ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ°. ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΠΏΡΠΎΠΈΡΡ
ΠΎΠ΄ΠΈΡ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΠ΅ΠΏΠ΅ΠΉ ΠΠΠ Π½Π° ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΎΡΠ½ΠΎΠΌ ΡΡΠ°ΡΡΠΊΠ΅ ΠΈ Π½Π°ΡΠΈΠ½Π°Π΅ΡΡΡ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅Π· Π ΠΠ-ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠ°. ΠΠΎΡΠ»Π΅ Π½Π΅ΡΠΊΠΎΠ»ΡΠΊΠΈΡ
ΡΠΈΠΊΠ»ΠΎΠ² ΡΠΈΠ½ΡΠ΅Π·Π° Π°Π±ΠΎΡΡΠΈΠ²Π½ΡΡ
ΠΏΡΠΎΠ΄ΡΠΊΡΠΎΠ² ΠΏΡΠΎΠΈΡΡ
ΠΎΠ΄ΠΈΡ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Ρ
ΠΎΠ΄ ΠΊ ΡΠ»ΠΎΠ½Π³Π°ΡΠΈΠΈ. ΠΠ° ΡΡΠΎΠΉ ΡΡΠ°Π΄ΠΈΠΈ ΠΏΡΠΎΠΈΡΡ
ΠΎΠ΄ΠΈΡ ΡΠ΄Π»ΠΈΠ½Π½Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π ΠΠ Π΄ΠΎ ΡΠ΅Ρ
ΠΏΠΎΡ, ΠΏΠΎΠΊΠ° ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½Ρ Π½Π΅ Π²ΡΡΡΠ΅ΡΠΈΡ ΡΠΈΠ³Π½Π°Π» ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΠΈ, ΡΡΠΎ ΠΏΡΠΈΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΡ ΠΊ Π΄ΠΈΡΡΠΎΡΠΈΠ°ΡΠΈΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ»Π΅ΠΊΡΠ° ΠΈ Π²ΡΡΠ²ΠΎΠ±ΠΎΠΆΠ΄Π΅Π½ΠΈΡ Π³ΠΎΡΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ Π ΠΠΠΏΡΠΎΠ΄ΡΠΊΡΠ°. ΠΠΎΡΠ»Π΅Π΄Π½ΠΈΠ΅ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΠΈΠ»ΠΈ ΡΠ΄Π΅Π»Π°ΡΡ ΠΊΠ°ΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΠΉ ΡΠΊΠ°ΡΠΎΠΊ Π² ΠΏΡΠΎΠ±Π»Π΅ΠΌΠ΅ ΠΏΠΎΠ½ΠΈΠΌΠ°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ° ΡΠ»ΠΎΠ½Π³Π°ΡΠΈΠΈ. Π ΡΠΎ ΠΆΠ΅ Π²ΡΠ΅ΠΌΡ Π½Π°ΠΈΠ±ΠΎΠ»ΡΡΠΈΠΉ ΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠ΅Ρ, ΠΊΠ°ΠΊ ΠΌΠ΅Π½Π΅Π΅ ΠΈΠ·ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠ΅, ΠΏΡΠ΅Π΄ΡΡΠ°Π²Π»ΡΡΡ ΡΡΠ°Π΄ΠΈΠΈ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΈΠΈ ΠΈ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΠΈ. Π¦Π΅Π»ΡΠΌΠΈ Π΄Π°Π½Π½ΠΎΠΉ ΡΠ°Π±ΠΎΡΡ ΡΠ²Π»ΡΠ»ΠΎΡΡ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°ΡΡΠ΅ΠΉ ΠΈ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΎΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΉ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° Π ΠΠ-ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΡΠ°Π³Π° Π’7 ΠΈ Π²ΡΡΡΠ½Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΡΠΈΠ½ΡΠΈΠΏΠ° Π΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΡ ΠΠ’Π ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ°. Π ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΡΡΠ΅ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΉ ΡΠ΅ΡΠ°Π»ΠΈΡΡ ΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠΈΠ΅ Π·Π°Π΄Π°ΡΠΈ (Π°) ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π²Π»ΠΈΡΠ½ΠΈΡ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° Ρ ΠΠΠ Π½Π° ΡΡΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΡ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΈΠΈ- (Π±) ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π΄Π»ΠΈΠ½Ρ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°ΡΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΡΠ°ΡΡΠΊΠ° ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° ΠΏΡΠΈ ΠΊΠΎΡΠΎΡΠΎΠΉ ΠΏΡΠΎΠΈΡΡ
ΠΎΠ΄ΠΈΡ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΈΡ- (Π²) Π²ΡΡΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π²ΠΎΠ·ΠΌΠΎΠΆΠ½ΡΡ
ΠΈΠ½ΡΡ
ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΉ ΡΡΠ°ΡΡΠΊΠ° ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ- (Π³) ΠΌΠΎΠ΄Π΅Π»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ Π²Π·Π°ΠΈΠΌΠΎΠ΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° Ρ ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΌ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠΎΠΌ ΠΏΡΠΈ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½ΠΈΠΈ Π΄Π²ΡΡ
ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π°, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΡΠ°ΡΡΠΎΠΊ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ°- (Π΄) ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΠΠΠ Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΠΎΠΉ Π΄Π»Ρ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΠ’Π ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ°- (Π΅) Π²ΡΡΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΡΡΡΠΊΡΡΡΡ ΠΠΠ Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΠΎΠΉ Π΄Π»Ρ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΠ’Π ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ°. ΠΠΏΠ΅ΡΠ²ΡΠ΅ ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ ΡΡΠ°ΡΡΠΎΠΊ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° Π½Π΅ΡΡΡ Π΄ΡΡΠ³ΡΡ Π²Π°ΠΆΠ½ΡΡ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΡ, ΠΏΠΎΠΌΠΈΠΌΠΎ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°ΡΡΠ΅ΠΉ — Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π°ΡΠΈΡ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Π² ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎ-ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΡΠ½ΠΎΠ΅ ΡΠΎΡΡΠΎΡΠ½ΠΈΠ΅. ΠΡΠΎΠ΄Π΅ΠΌΠΎΠ½ΡΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π° ΡΠ°Π½Π΅Π΅ Π½Π΅ ΠΎΠΏΠΈΡΠ°Π½Π½Π°Ρ Π²ΠΎΠ·ΠΌΠΎΠΆΠ½ΠΎΡΡΡ ΡΠΈΠ·ΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°ΡΡΠΊΠΎΠ² ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΈ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΈΠΈ Π΄Π»Ρ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° Π’7 Π ΠΠΠ. ΠΠΏΠ΅ΡΠ²ΡΠ΅ ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ Π’7 Π ΠΠΠ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠΈΡΡΠ΅Ρ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅Π· Π ΠΠ Π½Π° ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΠΠ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅ΠΉ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ. ΠΠΏΠ΅ΡΠ²ΡΠ΅ ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½Π° ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½Π°Ρ Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π½Π°Ρ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ Π½ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΈΠΏΠ° ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΈΠ³Π½Π°Π»Π° Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Π±Π°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠΎΡΠ°Π³Π° Π’7 (ATCTGTT Π² Π½Π΅ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠΈ). ΠΡΠΈ ΠΌΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ Π² Π»ΡΠ±ΠΎΠΌ ΠΈΠ· ΠΏΠΎΠ»ΠΎΠΆΠ΅Π½ΠΈΠΉ ΡΡΠΎΠ³ΠΎ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΡΠ° ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΠΈ Π½Π΅ ΠΏΡΠΎΠΈΡΡ
ΠΎΠ΄ΠΈΡ. ΠΠΏΠ΅ΡΠ²ΡΠ΅ ΠΏΡΠΎΠ΄Π΅ΠΌΠΎΠ½ΡΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ Π΄Π»Ρ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΠΈ Π°Π±ΡΠΎΠ»ΡΡΠ½ΠΎ Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΠΎ Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΠ΅ i i^ Π½Π΅ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠΈ Π² ΡΠ°ΠΉΠΎΠ½Π΅ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ°, ΠΈΠ½ΡΠΌΠΈ ΡΠ»ΠΎΠ²Π°ΠΌΠΈ Π΄Π²ΡΡΠΏΠΈΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΠΠΠ. ΠΠ°ΠΆΠ΅ ΠΏΡΠΈ Π½Π΅Π·Π½Π°ΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΡΡ
Π½Π°ΡΡΡΠ΅Π½ΠΈΡΡ
Π½Π΅ΠΏΡΠ΅ΡΡΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ Π½Π΅ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠΈ (ΡΠ°Π·ΡΡΠ²Π° Ρ ΠΎΡΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΎΠ΄Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π°) ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π΄ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠΎΠΌ ΡΡΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΠΈ Π·Π½Π°ΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ ΡΠ½ΠΈΠΆΠ°Π΅ΡΡΡ.
1. ΠΡΠΎΠ΄Π΅ΠΌΠΎΠ½ΡΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ ΡΡΠ°ΡΡΠΎΠΊ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° Π ΠΠ-ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΡΠ°Π³Π° Π’7 Π²ΡΠΏΠΎΠ»Π½ΡΠ΅Ρ Π΄Π²Π΅ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΈ: ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠ²Π°Π΅Ρ ΠΏΡΠΈΠ²Π»Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΠΊ ΠΠΠ ΠΈ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π°ΡΠΈΡ Π ΠΠ-ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΡΠ°Π³Π° Π’7 Π² ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎ-ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΡΠ½ΠΎΠ΅ ΡΠΎΡΡΠΎΡΠ½ΠΈΠ΅.2. ΠΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Π° ΡΠ°Π³Π° Π’7 ΠΏΡΠΈΠΎΠ±ΡΠ΅ΡΠ°Π΅Ρ ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±Π½ΠΎΡΡΡ ΠΊ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΈΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΈ Π½Π° ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠΌ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ΅ ΠΏΡΠΈ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½ΠΈΠΈ Π² ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΡ Π΄Π²ΡΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π°, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅Π³ΠΎ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΡΡΠ°ΡΡΠΊΠ° ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ°.3. ΠΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π°ΡΠΈΡ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Π½Π΅Π²ΠΎΠ·ΠΌΠΎΠΆΠ½Π° ΠΏΡΠΈ Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΠΈ ΠΌΡΡΠ°ΡΠΈΠΉ Π½Π° ΡΡΠ°ΡΡΠΊΠ΅ ΡΠ²ΡΠ·ΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° Π² ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π΅ ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠΈ.4. ΠΡΠ΅Π΄Π»ΠΎΠΆΠ΅Π½Π° ΠΌΠΎΠ΄Π΅Π»Ρ Π²Π·Π°ΠΈΠΌΠΎΠ΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΡ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Ρ ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΌ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠΎΠΌ Π½Π° Π½Π°ΡΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΡΠ°Π΄ΠΈΠΈ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠ°ΡΠΈΠΈ.5. ΠΡΠΎΠ΄Π΅ΠΌΠΎΠ½ΡΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΠΠ’Π ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ° (ATCTGTT) ΡΠ·Π½Π°ΡΡΡΡ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·ΠΎΠΉ ΡΠ°Π³Π° Π’7 ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈ. ΠΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ Π² ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π΅ ΡΡΠΎΠ³ΠΎ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΡΠ° Π½Π°ΡΡΡΠ°ΡΡ ΡΡΠ½ΠΊΡΠΈΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ°.6. ΠΡΠΎΠ΄Π΅ΠΌΠΎΠ½ΡΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π° Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΠΎΡΡΡ Π½Π΅ΠΏΡΠ΅ΡΡΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ Π΄Π²ΠΎΠΉΠ½ΠΎΠΉ ΡΠΏΠΈΡΠ°Π»ΠΈ ΠΠΠ Π΄Π»Ρ ^ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΠΈ Π½Π° ΠΠ’Π ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ΅ Π² ΡΠ°ΠΉΠΎΠ½Π΅ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ° ΠΈ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π΄ Π½ΠΈΠΌ. ΠΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΠ΅ ΡΠ°Π³ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ Π»ΠΈΠ·ΠΎΡΠΈΠΌΠ° Π½Π΅ ΡΡΠΈΠΌΡΠ»ΠΈΡΡΠ΅Ρ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΈΡ Π½Π° ΠΠ’Π ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ΅ Π² Π²ΠΈΠ΄Π΅ ΠΎΠ΄Π½ΠΎΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΠΠ. ΠΡΠ»ΠΈΡΠΈΠ΅ ΠΏΡΠΈΠ½ΡΠΈΠΏΠ° Π²Π·Π°ΠΈΠΌΠΎΠ΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΡ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Ρ Π΄Π°Π½Π½ΡΠΌ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠΎΠΌ ΠΎΡ ΡΠΏΠΈΠ»ΡΠΊΠΎΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΡΡΠΈΡ
ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠΎΠ² ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΡΠ΅Ρ ΠΎΡΠ½Π΅ΡΡΠΈ ΠΠ’Π ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡ ΠΊ ΠΎΡΠ΄Π΅Π»ΡΠ½ΠΎΠΌΡ ΠΊΠ»Π°ΡΡΡ Π. ΠΠΠ’ΠΠ ΠΠΠΠ« Π ΠΠΠ’ΠΠΠ« ΠΠ°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠ°Π»ΡΠ½ΡΠ΅ ΡΡΠ°ΠΌΠΌΡ Π ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ΅ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠΈΠ΅ ΡΡΠ°ΠΌΠΌΡ Escherichia coir. Π¨ΡΠ°ΠΌΠΌ ΠΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠΏ ΠΡΠΎΠΈΡΡ
ΠΎΠΆΠ΄Π΅Π½ΠΈΠ΅ BL21 Π. ΡΠΎΠΠ: Fdcm ompThsdS (Π³Π²Π³ΠΏΠ²Π³) Π΄Π°/ Novagen, Π‘Π¨Π DH5a Π1Π°ΡΠΈ1Π±9(Ρ80 dlacZAMlS) recAl endAl Π΄ΡΠ³Π96 Life Technologies, Π‘Π¨Π thi-1 hsdR17supE44 relAl XL-1 Blue recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17supE44 relAl Stratagene, Π‘Π¨Π lac [FproAB lacFZAIHlS TnlO (Tef)] ΠΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ ΠΠ»Ρ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Π΄ΠΈΠΊΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΈΠΏΠ° ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ ΡΠΠ161 (ΠΠ΅ ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1997). ΠΡΠΈ ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ
ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡ Π΄Π»Ρ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΡΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Π’7 ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ ΡΠΠ183, ΡΠΠ202, ΡΠΠ220, ΡΠΠ221, ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠ΅ Π»ΠΈΠ½Π΅Π°ΡΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΉ ΡΠ½Π΄ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ Hind I I I (ΠΠ΅ ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1998).ΠΠΈΡΠ°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΡΠ΅ ΡΡΠ΅Π΄Ρ ΠΠ»Ρ Π²ΡΡΠ°ΡΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΡΡ
ΠΊΡΠ»ΡΡΡΡ ΠΏΡΠΈ Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠΈ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄ ΠΈ Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ² ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»Π°ΡΡ ΠΏΠΈΡΠ°ΡΠ΅Π»ΡΠ½Π°Ρ ΡΡΠ΅Π΄Π° ΠΡΡΠΈΡ-ΠΠ΅ΡΡΠ°Π½ΠΈ (LB) (Sambrook ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1989). Π ΡΠ²ΡΡΠ΄ΡΠ΅ ΡΡΠ΅Π΄Ρ Π΄Π»Ρ Π·Π°Π»ΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΡΠ°ΡΠ΅ΠΊ ΠΠ΅ΡΡΠΈ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 1,5% Π°Π³Π°ΡΠ°. ΠΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΡ Π°ΠΌΠΏΠΈΡΠΈΠ»Π»ΠΈΠ½Π° ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ»Π° 100 ΠΌ ΠΊΠ³/ΠΌΠ».ΠΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΡΠ½ΡΡ
ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΠΊ ΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΡΠΎΡΠΌΠ°ΡΠΈΡ Π±Π°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠΉ ΠΠΎΠΌΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΡΠ½ΡΠ΅ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΊΠΈ Π²ΡΡΠ΅ΡΠΏΠΎΠΌΡΠ½ΡΡΡΡ
ΡΡΠ°ΠΌΠΌΠΎΠ² Π³ΠΎΡΠΎΠ²ΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΠΎ ΠΎΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΈΡ ΠΈ Ρ
ΡΠ°Π½ΠΈΠ»ΠΈ Π².
30% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½Π΅ Π² ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΠΈ 50 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄Π° ΠΊΠ°Π»ΡΡΠΈΡ ΠΏΡΠΈ -70** Π’ΡΠ°Π½ΡΡΠΎΡΠΌΠ°ΡΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΠΎ ΠΎΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΈΡ Π‘ΡΠΌΠ±ΡΡΠΊΠ° ΠΈ ΡΠΎΡΡ. (Sambrook ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1989).ΠΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ ΠΠΠ ΠΠ»Ρ Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ Π±ΠΎΠ»ΡΡΠΈΡ
ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ² ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ ΠΠΠ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ ΡΠ΅Π»ΠΎΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΠ° Ρ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠΈΠΌ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΡΡΠΈΠ»Π΅Π½Π³Π»ΠΈΠΊΠΎΠ»Ρ (Sambrook ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1989). Π ΠΌΠΈΠΊΡΠΎΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²Π°Ρ
ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π½ΡΡ ΠΠΠ Π²ΡΠ΄Π΅Π»ΡΠ»ΠΈ Π½Π° ΡΠΈΠ»ΠΈΠΊΠ°Π³Π΅Π»Π΅Π²ΡΡ
ΠΌΠ΅ΠΌΠ±ΡΠ°Π½Π½ΡΡ
ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΠ°Ρ
QUIAprep Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π½Π°Π±ΠΎΡΠ° ΡΠΈΡΠΌΡ Qiagen, Π‘Π¨Π. ΠΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² Π² ΠΏΡΠΎΡΠ΅Π΄ΡΡΠ°Ρ
ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ Π ΠΏΡΠΎΡΠ΅Π΄ΡΡΠ°Ρ
ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ ΠΠΠ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΠ°Π·Π»ΠΈΡΠ½ΡΠ΅ ΡΠ΅ΡΠ³ΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠ΅ ΡΠ½Π΄ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Ρ, ΡΠ΅Π»ΠΎΡΠ½ΡΡ ΡΠΎΡΡΠ°ΡΠ°Π·Ρ ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΊΠ° ΠΈ Π’4 ΠΠΠ Π»ΠΈΠ³Π°Π·Ρ (New England Biolabs, Π‘Π¨Π).ΠΠ»Ρ ΠΏΠΎΠ²ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΡΡΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠ΄ΡΠΊΡΠΎΠ² ΠΠ¦Π ΠΈΡ
ΡΠΎΡΠΎΡΠΈΠ»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΠΎ 5';
ΠΊΠΎΠ½ΡΡ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ Π’4 ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ ΠΊΠΈΠ½Π°Π·Ρ (New England Biolabs, Π‘Π¨Π).ΠΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π· ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² ΠΠΠ Π² Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΡΡ
Π³Π΅Π»ΡΡ
ΠΠ»Ρ ΠΈΠ΄Π΅Π½ΡΠΈΡΠΈΠΊΠ°ΡΠΈΠΈ, ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΈ ΠΎΡΠΈΡΡΠΊΠΈ ΠΌΠΎΠ»Π΅ΠΊΡΠ» ΠΠΠ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π· Π² 1;
2% Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΡΡ
Π³Π΅Π»ΡΡ
Π² 0,04 Π ΡΡΠΈΡ-Π°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΠΎΠΌ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ΅, ΡΠ 7,8 (Sambrook ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1989). ΠΡΠΈ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠΈ Π² ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΡ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 10 ΠΊΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ Π±ΡΡΠ΅Ρ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΉ 0,04 Π ΡΡΠΈΡ Π°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ Π±ΡΡΠ΅Ρ, 50% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½, 0.25% Π±ΡΠΎΠΌΡΠ΅Π½ΠΎΠ»ΠΎΠ²ΡΠΉ ΡΠΈΠ½ΠΈΠΉ ΠΈ 0.25% ΠΊΡΠΈΠ»Π΅Π½ΡΠΈΠ°Π½ΠΎΠ». ΠΠ½Π°Π»ΠΈΠ· ΠΏΠ΅ΡΠ²ΠΈΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΠΠΠ ΠΠ»Ρ ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΠΠΠ Π² ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π΅ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ ΡΠ΅ΠΊΠ²Π΅Π½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΠΎ Π‘ΡΠ½Π³Π΅ΡΡ Ρ Π΄Π²ΡΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠΈ ΠΠΠ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ Π½Π°Π±ΠΎΡΠ° Sequenase 2.0 DNA sequencing ΡΠΈΡΠΌΡ USB (Π‘Π¨Π) ΡΠΎΠ³Π»Π°ΡΠ½ΠΎ ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ΅Π½Π΄Π°ΡΠΈΠΈ ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΡΠ΅Π»Ρ. Π ΠΊΠ°ΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅ ΡΠ°Π΄ΠΈΠΎΠ°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΠΉ ΠΌΠ΅ΡΠΊΠΈ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π°-^^ΠΠΠ’Π (NEN, Π‘Π¨Π). ΠΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π½ΡΠ΅ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΡ Π·Π°ΠΊΠ°Π·ΡΠ²Π°Π»ΠΈ Π² Macromolecular Resources, Π‘Π¨Π. ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΠΏΡΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π² 6% ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΌ Π³Π΅Π»Π΅ Π² Π΄Π΅Π½Π°ΡΡΡΠΈΡΡΡΡΠΈΡ
ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡΡ
Π³Π΅Π»Ρ ΡΠΈΠΊΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π² ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ΅, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅ΠΌ 15% ΠΌΠ΅ΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π°, 5% ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΡ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 30 ΠΌΠΈΠ½., ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π½Π° ΡΠΈΠ»ΡΡΡΠΎΠ²Π°Π»ΡΠ½ΡΡ Π±ΡΠΌΠ°Π³Ρ 3 ΠΌΠΌ Chr (Whatman, Π‘Π¨Π) ΠΈ Π²ΡΡΡΡΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ Π½Π° ΡΡΡΠΈΠ»ΠΊΠ΅ Slab Dryer 483 (Bio-Rad, Π‘Π¨Π). ΠΡΡΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠ΅ Π³Π΅Π»ΠΈ ΡΠΊΡΠΏΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 14−18 ΡΠ°ΡΠΎΠ² Ρ ΡΠ΅Π½ΡΠ³Π΅Π½ΠΎΠ²ΡΠΊΠΎΠΉ ΠΏΠ»ΡΠ½ΠΊΠΎΠΉ RX-B (Labscientific, Π‘Π¨Π) ΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ²Π»ΡΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ Π°Π²ΡΠΎΠΌΠ°ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡΠΈΠ±ΠΎΡΠ° X;
ΠΠΠΠ’ Π35 processor (Kodak, Π‘Π¨Π).Π Π°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π ΠΠ ΠΈ ΠΠΠ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ Π΄Π΅Π½Π°ΡΡΡΠΈΡΡΡΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π² ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΡΡ
Π³Π΅Π»ΡΡ
ΠΠ»Ρ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠ΄ΡΠΊΡΠΎΠ² ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ
ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΉ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π· Π².
12% ΠΈΠ»ΠΈ 20% ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΡΡ
Π³Π΅Π»ΡΡ
(ΡΠΎΠΎΡΠ½ΠΎΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ Π°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π° ΠΊ ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»Π΅Π½Π±ΠΈΡΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Ρ.
19:1) Π² ΡΡΠΈΡΠ±ΠΎΡΠ°ΡΠ½ΠΎΠΌ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ΅ (0,09 Π Π’ΡΠΈΡ — Π±ΠΎΡΠ½Π°Ρ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΠ°, 2 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π, ΡΠ 8,0−8,5) Π² ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΠΈ 7 Π ΠΌΠΎΡΠ΅Π²ΠΈΠ½Ρ (Sambrook ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1989). ΠΠ΅ΡΠ΅Π΄ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠΎΠ² ΠΊ Π½ΠΈΠΌ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ ΡΠ°Π²Π½ΡΠΉ ΠΎΠ±ΡΡΠΌ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ. ΠΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΠΎΡΠΎΡΠ°Π²Π°: Π±ΡΡΠ΅Ρ Ρ ΠΌΠΎΡΠ΅Π²ΠΈΠ½ΠΎΠΉ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΉ Π΄Π²ΡΠΊΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ ΡΡΠΈΡ-Π±ΠΎΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ Π±ΡΡΠ΅Ρ, 8 Π ΠΌΠΎΡΠ΅Π²ΠΈΠ½Ρ ΠΈ 50 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π, Π° ΡΠ°ΠΊΠΆΠ΅ ΡΠΎΡΠΌΠ°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΡΠΉ Π±ΡΡΠ΅Ρ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΉ 90% ΡΠΎΡΠΌΠ°ΠΌΠΈΠ΄ ΠΈ 50 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π. ΠΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π· ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΡΡΠΎΡΠ½Π½ΠΎΠΉ ΠΌΠΎΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ 85 ΠΡ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠΎΡΠ° ΡΠ°ΡΠΎΠ² Π΄Π»Ρ.
20% Π³Π΅Π»Π΅ΠΉ ΠΈ 75 ΠΡ, 1 ΡΠ°Ρ Π΄Π»Ρ 12% Π³Π΅Π»Π΅ΠΉ. ΠΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ΅ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ² Π² Π΄Π΅Π½Π°ΡΡΡΠΈΡΡΡΡΠΈΡ
ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡΡ
ΠΠ»Ρ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π° ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠΎΠ² ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ΅ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ² Π² 7% ΠΈ.
10% ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΡΡ
Π³Π΅Π»ΡΡ
Π² ΡΡΠΈΡΠ³Π»ΠΈΡΠΈΠ½ΠΎΠ²ΠΎΠΌ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ΅ Π² ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΠΈ Π΄ΠΎΠ΄Π΅ΡΠΈΠ»ΡΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ° Π½Π°ΡΡΠΈΡ (Sambrook ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1989). ΠΠ΅ΡΠ΅Π΄ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π½Π° Π³Π΅Π»Ρ ΠΊ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠ°ΠΌ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ ΡΠ΅ΡΡΡΡΡ
ΠΊΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ Π±ΡΡΠ΅Ρ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ (0,2 Π Π’ΡΠΈΡΠ‘1, ΡΠ 6,8, 4% ΠΠ‘Π, 1 Π ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 2 ΠΌΠΈΠ½. ΠΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π· ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ Π² Π°ΠΏΠΏΠ°ΡΠ°ΡΠ΅ Miniprotean I I (Bio-Rad, Π‘Π¨Π). ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΠΏΡΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π³Π΅Π»Ρ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π² ΡΠΈΠΊΡΠΈΡΡΡΡΠΈΠΉ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΉ 10% ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΡ ΠΈ 45% ΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π°, ΠΈ Π½Π°Π³ΡΠ΅Π²Π°Π»ΠΈ Π΄ΠΎ ΠΊΠΈΠΏΠ΅Π½ΠΈΡ, Π·Π°ΡΠ΅ΠΌ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π½Π° ΠΊΠ°ΡΠ°Π»ΠΊΡ Π½Π° 10 ΠΌΠΈΠ½. ΠΡΠΎΠΊΡΠ°ΡΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ Π² 0,02% ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ΅ ΠΊΡΠΌΠ°ΡΡΠΈ Π±ΡΠΈΠ»Π»ΠΈΠ°Π½ΡΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ Π³ΠΎΠ»ΡΠ±ΠΎΠ³ΠΎ R450 Π² 10% ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΠ΅ Π½Π° ΠΊΠ°ΡΠ°Π»ΠΊΠ΅ (10 ΠΌΠΈΠ½.) Ρ ΠΏΡΠ΅Π΄Π²Π°ΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΡΠΌ Π½Π°Π³ΡΠ΅Π²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ. ΠΡΠΌΡΠ²ΠΊΡ ΠΎΡΡΡΠ΅ΡΡΠ²Π»ΡΠ»ΠΈ Π² ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΡΠΎΠΌ 5% ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ΅ ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΈΡΠ»ΠΎΡΡ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 10 ΠΌΠΈΠ½. Π½Π° ΠΊΠ°ΡΠ°Π»ΠΊΠ΅ Ρ ΠΏΠΎΠΌΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π² ΠΊΡΠ²Π΅ΡΡ Π±ΡΠΌΠ°ΠΆΠ½ΠΎΠΉ ΡΠ°Π»ΡΠ΅ΡΠΊΠΈ Kimwipes EX-L (Kimberly-Clark, Π‘Π¨Π) Π΄Π»Ρ Π°Π΄ΡΠΎΡΠ±ΡΠΈΠΈ ΠΈΠ·Π»ΠΈΡΠ½Π΅Π³ΠΎ ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²Π° ΠΊΡΠ°ΡΠΈΡΠ΅Π»Ρ. ΠΡΠΎΡΠ΅Π΄ΡΡΡ ΠΎΡΠΌΡΠ²ΠΊΠΈ ΠΏΠΎΠ²ΡΠΎΡΡΠ»ΠΈ, ΠΏΡΠΈ ΡΡΠΎΠΌ Π·Π°ΠΌΠ΅Π½ΡΠ»ΠΈ ΡΠ°Π»ΡΠ΅ΡΠΊΡ Π½Π° ΡΠ²Π΅ΠΆΡΡ. ΠΠ΅Π»Ρ ΡΠΎΡΠΎΠ³ΡΠ°ΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΡΠΎΡΠΎΠΊΠ°ΠΌΠ΅ΡΡ Polaroid (Π‘Π¨Π) ΠΈΠ»ΠΈ Ρ
ΡΠ°Π½ΠΈΠ»ΠΈ Π² Π²ΡΡΡΡΠ΅Π½Π½ΠΎΠΌ Π²ΠΈΠ΄Π΅. ΠΠ»Ρ ΡΡΠΎΠ³ΠΎ Π³Π΅Π»Ρ Π²ΡΠ΄Π΅ΡΠΆΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ Π½ΠΎΡΡ Π² 2% ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ΅ Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½Π°, ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π½Π° ΡΠΈΠ»ΡΡΡΠΎΠ²Π°Π»ΡΠ½ΡΡ Π±ΡΠΌΠ°Π³Ρ 3 ΠΌΠΌ Chr (Whatman, Π‘Π¨Π) ΠΈ Π²ΡΡΡΡΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ Π½Π° ΡΡΡΠΈΠ»ΠΊΠ΅ Slab Dryer 483 (Bio-Rad, Π‘Π¨Π).Π’ΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΡ in vitro ΠΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠ΅ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΡ ΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π°: ΠΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡ ΠΠΠ’: 30 ΠΌΠ HEPES, ΡΠ 7,8- 100 ΠΌΠ Π³Π»ΡΡΠ°ΠΌΠ°Ρ ΠΊΠ°Π»ΠΈΡ- 15 ΠΌΠ Π°ΡΠ΅ΡΠ°Ρ ΠΌΠ°Π³Π½ΠΈΡ- 0,25 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π- 0,05% ΡΠ²ΠΈΠ½-20- 1 ΠΌΠ ΠΠ’Π’. ΠΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡ ΡΡΠΈΡ-Π‘1: 20 ΠΌΠ Π’ΡΠΈΡ-Π‘1, ΡΠ 7,9- 8 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ ΠΌΠ°Π³Π½ΠΈΡ- 0,1 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π- 0,05% ΡΠ²ΠΈΠ½-20, 1 ΠΌΠ ΠΠ’Π’. Π’ΡΠΈΡ-Π°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡ: 40 ΠΌΠ Π’ΡΠΈΡ-Π°ΡΠ΅ΡΠ°Ρ, ΡΠ 7,9- 10 ΠΌΠ Π°ΡΠ΅ΡΠ°Ρ ΠΌΠ°Π³Π½ΠΈΡ- 0.05% ΡΠ²ΠΈΠ½-20, 1 ΠΌΠ ΠΠ’Π’. ΠΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠ΅ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΡ ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠ°Π²Π»ΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ Π² Π΄Π΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠ°ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ (ΠΠΠ’ Π².
ΠΏΡΡΠΈΠΊΡΠ°ΡΠ½ΠΎΠΉ) Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π΄Π΅ΠΈΠΎΠ½ΠΈΠ·ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠΉ Π²ΠΎΠ΄Ρ, ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ Π½Π° ΡΡΡΠ°Π½ΠΎΠ²ΠΊΠ΅ Milli-Q ΠΡΠΎΠΌΠ΅ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° Π² ΠΊΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΡ ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΎΠ±ΡΡΠ½ΠΎ Π²Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΠΎ 0,5 ΠΌΠ ΠΠ’Π€, ΠΠ’Π€, Π¦Π’Π€, Π£Π’Π€, 0,2 ΠΌΠΊΠΠΈ Ρ-^Π ΠΠ’Π€ (ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠ°Ρ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΡ 6000 ΠΠΈ/ΠΌΠΌΠΎΠ»Ρ), 50 ΠΌΠΊΠ ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡΡ ΠΈ 20 Π½Π³ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ°. ΠΡΠΈ ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠΈ ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΉ ΡΠ½ΠΈΠΊΠ°Π»ΡΠ½ΡΠ΅ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΡ ΠΏΠΎΠΌΠ΅ΡΠ°Π»ΠΈ Π² ΠΈΠ½Π΄ΠΈΠ²ΠΈΠ΄ΡΠ°Π»ΡΠ½ΡΠ΅ ΠΏΡΠΎΠ±ΠΈΡΠΊΠΈ, Π° ΠΈΠ· ΠΎΠ±ΡΠΈΡ
ΠΊΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΠΎΠ² ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ ΡΠΌΠ΅ΡΡ Π΄Π»Ρ ΡΠ½ΠΈΡΠΈΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΠΉ. Π Π΅Π°ΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠ΅ ΡΠΌΠ΅ΡΠΈ ΠΈ ΠΈΠ½Π΄ΠΈΠ²ΠΈΠ΄ΡΠ°Π»Π½ΡΠ΅ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΡ, ΡΠ°Π·Π½Π΅ΡΡΠ½Π½ΡΠ΅ Π’ΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΡ ΠΈΠ½ΠΈΡΠΈΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΡΠΌΠ΅ΡΠΈ ΠΊ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΡ (ΠΏΡΠΈ ΡΠ΅ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΈ ΡΠ°Π·Π½ΡΡ
.
ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ²) ΠΈΠ»ΠΈ ΡΠΌΠ΅ΡΠΈ ΠΊ ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡΠ΅ (ΠΏΡΠΈ ΡΠ΅ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΈ ΡΠ°Π·Π»ΠΈΡΠ½ΡΡ
ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡ).ΠΠ»Ρ ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΉ Π½Π°ΠΊΠΎΠΏΠ»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠ΄ΡΠΊΡΠΎΠ² ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΈ Π² Π·Π°Π²ΠΈΡΠΈΠΌΠΎΡΡΠΈ ΠΎΡ Π²ΡΠ΅ΠΌΠ΅Π½ΠΈ ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠ°Π²Π»ΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΎΠ±ΡΡΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ ΡΠΌΠ΅ΡΡ, ΠΈΠ· ΠΊΠΎΡΠΎΡΠΎΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅ Π½Π°ΡΠ°Π»Π° ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΎΡΠ±ΠΈΡΠ°Π»ΠΈ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΡ ΡΠ°Π²Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠ° ΡΠ΅ΡΠ΅Π· Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ
ΠΎΠ΄ΠΈΠΌΡΠ΅ Π²ΡΠ΅ΠΌΠ΅Π½Π½ΡΠ΅ ΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠ²Π°Π»Ρ. ΠΠ±ΡΠ°Π·ΡΡ ΡΠΌΠ΅ΡΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ Ρ ΡΠ°Π²Π½ΡΠΌ ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠΎΠΌ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π΄Π»Ρ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠΎΠ². ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΠΏΡΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π³Π΅Π»Ρ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π½Π° ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΠΉ Π»ΠΈΡΡ ΡΠ΅Π½ΡΠ³Π΅Π½ΠΎΠ²ΡΠΊΠΎΠΉ ΠΏΠ»ΡΠ½ΠΊΠΈ ΠΈΠ»ΠΈ Π»ΠΈΡΡ ΡΠΈΠ»ΡΡΡΠΎΠ²Π°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π±ΡΠΌΠ°Π³ΠΈ 3 ΠΌΠΌ Chr (Whatman, Π‘Π¨Π) ΠΈ ΡΠΊΡΠΏΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Ρ ΡΠΊΡΠ°Π½ΠΎΠΌ Phospoimager (Molecular Dynamics). ΠΠΊΡΠ°Π½ ΡΠΊΠ°Π½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π½Π° ΠΏΡΠΈΠ±ΠΎΡΠ΅ Storm 860 (Molecular Dynamics). Π Π΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΡ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΠΏΡΠΎΠ³ΡΠ°ΠΌΠΌΡ ImageQuant 4.2 ΠΈ ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics).ΠΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ
ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡ ΠΈΠ· ΡΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΡ
ΠΠΠ ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΎΠ² ΠΠ»Ρ ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ
ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Ρ ΡΠΈΡΠΌ Oligos, Π‘Π¨Π ΠΈ Macromolecular Resources, Π‘Π¨Π. ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠΉ ΡΡΡ
ΠΎΠΉ ΠΎΡΠ°Π΄ΠΎΠΊ ΠΠΠ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΡΠ»ΠΈ Π² Π΄Π΅ΠΈΠΎΠ½ΠΈΠ·ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠΉ Π²ΠΎΠ΄Π΅ Milli-Q (Millipore, Π‘Π¨Π) Π² ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠ΅ ΠΎΡ 20 ΠΌΠΊΠ» Π΄ΠΎ 100 ΠΌΠΊΠ», Π² Π·Π°Π²ΠΈΡΠΈΠΌΠΎΡΡΠΈ ΠΎΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΈΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π²ΡΡ
ΠΎΠ΄Π° ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΈ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅Π·Π°. ΠΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΡ ΠΠΠ ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»ΡΠ»ΠΈ Π½Π° ΡΠΏΠ΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠΎΠΌΠ΅ΡΡΠ΅ Ultraspec I I (Pharmacia LKB, England). ΠΡΠΆΠΈΠ³ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ Π² ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠ΅ 40 ΠΌΠΊΠ» ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ°, Π²ΠΊΠ»ΡΡΠ°Π²ΡΠ΅ΠΌ ΠΏΠΎ 2 ΠΌΠΊΠ» ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° (ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΡ 10 ΠΌΠΊΠ) ΠΊΠ°ΠΆΠ΄ΠΎΠ³ΠΎ ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π°. Π‘ΠΌΠ΅ΡΡ Π²ΡΠ΄Π΅ΡΠΆΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ 10 ΠΌΠΈΠ½. ΠΏΡΠΈ 70® Π‘, ΠΏΠΎΡΠ»Π΅ ΡΠ΅Π³ΠΎ ΠΏΠΎΠ΄Π²Π΅ΡΠ³Π°Π»ΠΈ ΠΌΠ΅Π΄Π»Π΅Π½Π½ΠΎΠΌΡ ΠΎΡ
Π»Π°ΠΆΠ΄Π΅Π½ΠΈΡ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠΎΡΠ° ΡΠ°ΡΠΎΠ² ΠΏΡΠΈ ΠΊΠΎΠΌΠ½Π°ΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΌΠΏΠ΅ΡΠ°ΡΡΡΠ΅. ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΡΡ
ΠΌΡΡΠ°ΡΠΈΠΉ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄-Π½Π°ΠΏΡΠ°Π²Π»Π΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΌΡΡΠ°Π³Π΅Π½Π΅Π·Π° Π’ΠΎΡΠ΅ΡΠ½ΡΠ΅ Π·Π°ΠΌΠ΅Π½Ρ Π² ΠΠ’Π ΡΠΈΠ³Π½Π°Π»Π΅ Π±ΡΠ»ΠΈ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Ρ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΠΠ¦Π Π½Π° ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π΅ ΡΠΠ220. ΠΠΌΠΏΠ»ΠΈΡΠΈΠΊΠ°ΡΠΈΡ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ PrimeZyme (Biometra) Π² ΡΠΎΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²ΠΈΠΈ Ρ J ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ΅Π½Π΄Π°ΡΠΈΡΠΌΠΈ ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΡΠ΅Π»Ρ. ΠΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΡ ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΈ Π² ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠ΅ 100 Π²ΠΊΠ»ΡΡΠ°Π»ΠΈ 10 ΠΌΠΊΠ» 10;
ΠΊΡΠ°ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ°, 10 Π½Π³ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ ΠΌΠ°ΡΡΠΈΡΡ, 1 ΠΌΠΊΠ ΠΊΠ°ΠΆΠ΄ΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠ°, ΠΏΠΎ 200 ΠΌΠΊΠ Π΄ΠΠ’Π€, Π΄ΠΠ’Π€, Π΄Π¦Π’Π€, Π΄Π’Π’Π€, 1,5 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ ΠΌΠ°Π³Π½ΠΈΡ ΠΈ 1 Π΅Π΄ΠΈΠ½ΠΈΡΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠΎΡΡΠ°Π±ΠΈΠ»ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ PrimeZyme. ΠΠ±ΡΠΈΠΉ Π΄Π»Ρ Π²ΡΠ΅Ρ
ΡΠ΅Π°ΠΊΡΠΈΠΉ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅Ρ DL31 (5' GTGAAITCAATTAATACGACTCACTATAG) ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°Π» ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° ΠΈ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠΉ ΡΠ°ΠΉΡ EcoRI (ΠΏΠΎΠ΄ΡΡΡΠΊΠ½ΡΡΠΎ). ΠΡΠΎΡΠΎΠΉ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅Ρ Dl33 (5' GCTCTAGATATCAAAACAGATGATCCCCGGGTACCA) ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°Π» ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ° ΠΈ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠΉ ΡΠ°ΠΉΡ Xbal. ΠΠ»Ρ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΌΡΡΠ°ΡΠΈΠΉ Π² ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ° ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΠ°Π·Π»ΠΈΡΠ½ΡΠ΅ Π²Π°ΡΠΈΠ°Π½ΡΡ Π²ΡΠΎΡΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡΠ°ΠΉΠΌΠ΅ΡΠ° Ρ ΠΎΠ΄ΠΈΠ½ΠΎΡΠ½ΡΠΌΠΈ Π·Π°ΠΌΠ΅Π½Π°ΠΌΠΈ Π² ΡΠΎΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²ΡΡΡΠΈΡ
ΠΏΠΎΠ»ΠΎΠΆΠ΅Π½ΠΈΡΡ
ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ (ΡΠΌ. ΡΠ°Π±Π»ΠΈΡΡ). Π Π΅Π°ΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠ΅ ΡΠΌΠ΅ΡΠΈ Π½Π° ΠΏΡΠΈΠ±ΠΎΡΠ΅ MicroCycler Π (Eppendorf, Π‘Π¨Π) ΡΠΎ ΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠΈΠΌΠΈ ΠΏΠ°ΡΠ°ΠΌΠ΅ΡΡΠ°ΠΌΠΈ ΠΈΠ½ΠΊΡΠ±Π°ΡΠΈΠΈ: 1 ΠΌΠΈΠ½. Π²ΡΡΠ΅ΡΠΏΠΎΠΌΡΠ½ΡΡΡΠΌΠΈ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠΌΠΈ ΡΠ½Π΄ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Π°ΠΌΠΈ ΠΈ ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π² ΠΏΡΠ΅Π΄Π²Π°ΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ ΠΎΠ±ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ°Π½Π½ΡΠΉ ΡΠ΅ΠΌΠΈ ΠΆΠ΅ ΡΠ½Π΄ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π·Π°ΠΌΠΈ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π½ΡΠΉ Π²Π΅ΠΊΡΠΎΡ pUC19 Ρ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄ ΠΏΡΠ΅Π΄ΡΡΠ°Π²Π»Π΅Π½Π½ΡΡ
Π² ΡΠ°Π±Π»ΠΈΡΠ΅. ΠΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΠΏΠΎΠ΄ΡΠ²Π΅ΡΠΆΠ΄Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΡΠ΅ΠΊΠ²Π΅Π½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ. ΠΠ΅ΡΠΎΠ΄ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΠΠ Π² Π½Π΅Π΄Π΅Π½Π°ΡΡΡΠΈΡΡΡΡΠΈΡ
ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡΡ
ΠΠ»Ρ ΡΠΊΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² ΠΠΠ ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ Π’4 ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΊΠ½Π°Π·Ρ (Sambrook ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1989). ΠΠ»Ρ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² ΠΠΠ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΡΠΈΡΠ°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΡΡ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΡ ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡ ΠΈ 10% ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΡΠΈ Π³Π΅Π»Ρ Ρ ΠΎΡΠ½ΠΎΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π° ΠΊ ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»Π΅Π½Π±ΠΈΡΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Ρ 19:1. ΠΠ΅ΡΠ΅Π΄ Π½Π°Π½ΠΎΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠΎΠ² ΠΊ Π½ΠΈΠΌ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 1/10 ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠ° Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ (0,04 Π ΡΡΠΈΡ-Π°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ Π±ΡΡΠ΅Ρ, 50% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½, 0.25% Π±ΡΠΎΠΌΡΠ΅Π½ΠΎΠ»ΠΎΠ²ΡΠΉ ΡΠΈΠ½ΠΈΠΉ ΠΈ 0.25% ΠΊΡΠΈΠ»Π΅Π½ΡΠΈΠ°Π½ΠΎΠ»). ΠΡΠΈ ΠΏΡΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΠΈ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΡΡΠΊΠ»Π° 170×170 ΠΌΠΌ, ΠΏΡΠΈ ΡΠΎΠ»ΡΠΈΠ½Π΅ Π³Π΅Π»Ρ 1.5 ΠΌΠΌ ΠΈ Π°ΠΏΠΏΠ°ΡΠ°Ρ ΠΌΠΎΠ΄Π΅Π»ΠΈ SE 400 (Hoefer Scientific Instruments, Π‘Π¨Π). Π Π°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ Π½Π°ΠΏΡΡΠΆΠ΅Π½ΠΈΠΈ 50−100 Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 5−7 ΡΠ°ΡΠΎΠ². ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΠΏΡΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π³Π΅Π»Ρ Π²ΡΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΠΈ ΠΈΠ· ΡΡΡΠΊΠΎΠ» ΠΈ ΡΠΊΡΠΏΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Ρ ΡΠΊΡΠ°Π½ΠΎΠΌ Phospoimager (Molecular Dynamics). ΠΠΊΡΠ°Π½ ΡΠΊΠ°Π½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π½Π° ΠΏΡΠΈΠ±ΠΎΡΠ΅ Storm 860 (Molecular Dynamics). Π Π΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΡ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ°ΠΌΠΌΡ ImageOuant 5.2 (Molecular Dynamics).ΠΠ΅ΡΠΎΠ΄ ΠΈΠ·ΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ ΠΏΠΎΠ΄Π²ΠΈΠΆΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΠΠΠ Π² ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΌ Π³Π΅Π»Π΅ ΠΠ»Ρ ΡΠΊΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² ΠΠΠ ΠΎΠ»ΠΈΠ³ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ Π’4 ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΊΠ½Π°Π·Ρ (Sambrook ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1989). ΠΠ»Ρ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² ΠΠΠ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΡΠΈΡΠ°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΡΡ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΡ ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡ ΠΈ 5% ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΡΠΈ Π³Π΅Π»Ρ Ρ ΠΎΡΠ½ΠΎΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π° ΠΊ ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»Π΅Π½Π±ΠΈΡΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Ρ 19:1. ΠΠ΅Π»Ρ ΠΈ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡ ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°Π» 10 ΠΌΠ Π°ΡΠ΅ΡΠ°Ρ ΠΌΠ°Π³Π½ΠΈΡ. ΠΠ±ΡΠ°Π·ΡΡ Π² ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠ΅ 10 ΠΌΠΊΠ» Π½Π°Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π² ΡΡΠΈΡ-Π°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΠΎΠΌ ΡΡΠ°Π½ΡΠΊΡΠΈΠΏΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΌ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ΅, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅ΠΌ 5% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½Π°. Π ΠΊΡΠ°ΠΉΠ½ΡΡ Π΄ΠΎΡΠΎΠΆΠΊΡ Π³Π΅Π»Ρ Π½Π°Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ ΡΠ°Π²Π½ΡΠΉ ΠΎΠ±ΡΡΠΌ ΡΠ°Π·Π±Π°Π²Π»Π΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π² 10 ΡΠ°Π· Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° Ρ ΠΊΡΠ°ΡΠΈΡΠ΅Π»Π΅ΠΌ (0,04 Π ΡΡΠΈΡ-Π°ΡΠ΅ΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ Π±ΡΡΠ΅Ρ,.
50% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½, 0.25% Π±ΡΠΎΠΌΡΠ΅Π½ΠΎΠ»ΠΎΠ²ΡΠΉ ΡΠΈΠ½ΠΈΠΉ ΠΈ 0.25% ΠΊΡΠΈΠ»Π΅Π½ΡΠΈΠ°Π½ΠΎΠ») Π΄Π»Ρ Π½Π°Π±Π»ΡΠ΄Π΅Π½ΠΈΡ Π·Π° ΡΡΠΎΠ½ΡΠΎΠΌ ΡΠ°Π·Π΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ. ΠΠ»Π΅ΠΊΡΠΎΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π· ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΡΡΠΎΡΠ½Π½ΠΎΠΉ ΡΠΈΠ»Π΅ ΡΠΎΠΊΠ° 35 ΠΌΠ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅.
3−4 ΡΠ°ΡΠΎΠ². ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΠΏΡΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΡ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π³Π΅Π»Ρ Π²ΡΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΠΈ ΠΈΠ· ΡΡΡΠΊΠΎΠ», ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π½Π° ΡΠΈΠ»ΡΡΡΠΎΠ²Π°Π»ΡΠ½ΡΡ Π±ΡΠΌΠ°Π³Ρ 3 ΠΌΠΌ Chr (Whatman, Π‘Π¨Π) ΠΈ Π²ΡΡΡΡΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ Π½Π° ΡΡΡΠΈΠ»ΠΊΠ΅ Slab Dryer 483 (Bio-Rad, Π‘Π¨Π). ΠΡΡΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠΉ Π³Π΅Π»Ρ ΡΠΊΡΠΏΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Ρ ΡΠΊΡΠ°Π½ΠΎΠΌ Phospoimager (Molecular Dynamics). ΠΠΊΡΠ°Π½ ΡΠΊΠ°Π½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π½Π° ΠΏΡΠΈΠ±ΠΎΡΠ΅ Storm 860 (Molecular Dynamics). Π Π΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΡ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ°ΠΌΠΌΡ ImageOuant 4.2 ΠΈ 5.2 (Molecular Dynamics).ΠΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π’7 Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π°ΡΡΠΈΠ½Π½ΠΎΠΉ Ρ
ΡΠΎΠΌΠ°ΡΠΎΠ³ΡΠ°ΡΠΈΠΈ ΠΠ»Ρ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΡΠ°ΠΌΠΌ BL21, Π½Π΅ΡΡΡΠΈΠΉ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ ΡΠΠ161, ΠΊΠΎΡΠΎΡΠ°Ρ Π½Π΅ΡΡΡ ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡΠΈΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΠΉ Π³Π΅Π½ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ Ρ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΡΠ΅ΡΡΠΈ ΠΎΡΡΠ°ΡΠΊΠΎΠ² Π³ΠΈΡΡΠΈΠ΄ΠΈΠ½Π° ΠΊ NΠΊΠΎΠ½ΡΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° (ΠΠ΅ ΠΈ ΡΠΎΡΡ., 1997). ΠΠ»Ρ ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΡ Π½ΠΎΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΡΠ»ΡΡΡΡΡ Π² ΠΏΡΠΎΠ±ΠΈΡΠΊΡ Ρ 3 ΠΌΠ» ΡΡΠ΅Π΄Ρ LB, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅ΠΉ 100 ΠΌΠΊΠ³/ΠΌΠ» Π°ΠΌΠΏΠΈΡΠΈΠ»Π»ΠΈΠ½Π°, ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ ΠΎΠ΄ΠΈΠ½ΠΎΡΠ½ΡΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡ ΡΠΎ ΡΠ²Π΅ΠΆΠ΅ΠΉ ΡΠ°ΡΠΊΠΈ ΠΈ ΠΈΠ½ΠΊΡΠ±ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ 16−18 ΡΠ°ΡΠΎΠ² Π±Π΅Π· Π²ΡΡΡΡΡ
ΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΈ 30″ 0,5 ΠΌΠ» ΠΊΡΠ»ΡΡΡΡΡ ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π² 100 ΠΌΠ» ΡΡΠ΅Π΄Ρ LB Π² ΠΊΠΎΠ»Π±Π΅ ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠΎΠΌ 500 ΠΌΠ» ΠΈ ΠΈΠ½ΠΊΡΠ±ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ 600 Π½ΠΌ, ΠΎΡΠ±ΠΈΡΠ°Π»ΠΈ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·Π΅Ρ ΠΊΡΠ»ΡΡΡΡΡ (1 ΠΌΠ») Π΄Π»Ρ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π° (ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΠΌ. Π½ΠΈΠΆΠ΅), ΠΏΠΎΡΠ»Π΅ ΡΠ΅Π³ΠΎ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 0,1 Π ΠΠΠ’Π Π΄ΠΎ ΠΊΠΎΠ½Π΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ 0,5 ΠΌΠ ΠΈ ΠΏΡΠΎΠ΄ΠΎΠ»ΠΆΠ°Π»ΠΈ ΠΈΠ½ΠΊΡΠ±Π°ΡΠΈΡ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 4 ΡΠ°ΡΠΎΠ². ΠΠ»Π΅ΡΠΊΠΈ ΡΠΎΠ±ΠΈΡΠ°Π»ΠΈ ΡΠ΅Π½ΡΡΠΈΡΡΠ³ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ (25 ΠΌΠΈΠ½., 3500 ΠΎΠ±/ΠΌΠΈΠ½ (Sorvall RT 6000 Π, Du Pont, Π‘Π¨Π)) Π² 50 ΠΌΠ» ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΏΡΠΎΠΏΠΈΠ»Π΅Π½ΠΎΠ²ΡΡ
ΠΏΡΠΎΠ±ΠΈΡΠΊΠ°Ρ
BlueMax (Becton Dickinson ΠΊΡΠ»ΡΡΡΡΡ ΠΎΡΠ±ΠΈΡΠ°Π»ΠΈ 125 ΠΌΠΊΠ», ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π² 1,5 ΠΌΠ» ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΏΡΠΎΠΏΠΈΠ»Π΅Π½ΠΎΠ²ΡΡ ΠΏΡΠΎΠ±ΠΈΡΠΊΡ Eppendotf, ΡΠ΅Π½ΡΡΠΈΡΡΠ³ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ 2 ΠΌΠΈΠ½. ΠΏΡΠΈ 15 000 ΠΎΠ±/ΠΌΠΈΠ½ (VSMC-13, Shelton Scientific, Π‘Π¨Π). ΠΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΡΠΉ ΠΎΡΠ°Π΄ΠΎΠΊ ΡΠ΅ΡΡΡΠΏΠ΅Π½Π΄ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π² 60 ΠΌΠΊΠ» Π²ΠΎΠ΄Ρ, Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 20 ΠΌΠΊΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ (0,2 Π Π’ΡΠΈΡ Π‘1, ΡΠ 6,8, 4% ΠΠ‘Π, 1 Π ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», 40% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½, 0,001% Π±ΡΠΎΠΌΡΠ΅Π½ΠΎΠ»ΠΎΠ²ΡΠΉ ΡΠΈΠ½ΠΈΠΉ) ΠΈ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°ΠΊΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΌ Π³Π΅Π»Π΅ (ΡΠΌ. Π²ΡΡΠ΅). Π Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΈΡΡΡΠΏΠ°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΈ Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΠΈ ΡΡΠ½ΠΎ Π²ΠΈΠ΄ΠΈΠΌΠΎΠΉ Π·ΠΎΠ½Ρ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π±Π΅Π»ΠΊΠ° ΠΏΠΎΡΠ»Π΅ ΠΈΠ½Π΄ΡΠΊΡΠΈΠΈ. ΠΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΡΠΉ ΠΎΡΠ°Π΄ΠΎΠΊ ΠΈΠ· 100 ΠΌΠ» ΠΊΡΠ»ΡΡΡΡΡ.
0,5 Π Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ Π½Π°ΡΡΠΈΡ, 0.05% ΡΠ²ΠΈΠ½-20, 5 ΠΌΠ Ρ-ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», 1 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π, 4% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½) Π² 15 ΠΌΠ» ΡΠ΅Π½ΡΡΠΈΡΡΠΆΠ½ΠΎΠΉ ΠΏΡΠΎΠ±ΠΈΡΠΊΠ΅. Π ΡΡΡΠΏΠ΅Π½Π·ΠΈΠΈ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 1/100 100 ΠΌΠ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΡΠ΅Π½ΠΈΠ»ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»ΡΡΠ»ΡΡΠΎΠ½ΠΈΠ»ΡΠ»ΡΠΎΡΠΈΠ΄Π° (Sigma, Π‘Π¨Π) Π΄Π»Ρ ΠΈΠ½Π³ΠΈΠ±ΠΈΡΠΎΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΡΠΎΡΠ΅Π°Π·Π½ΠΎΠΉ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΠΎΡΡΠΈ ΠΈ 1/100 10% ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° Π΄Π΅ΠΎΠΊΡΠΈΡ
ΠΎΠ»Π°ΡΠ° Π½Π°ΡΡΠΈΡ. ΠΠ»Π΅ΡΠΊΠΈ ΠΏΠΎΠ΄Π²Π΅ΡΠ³Π°Π»ΠΈ ΠΎΠ±ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠ΅ ΡΠ»ΡΡΡΠ°Π·Π²ΡΠΊΠΎΠΌ Π½Π° ΠΏΡΠΈΠ±ΠΎΡΠ΅ 550 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific) Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ 20 ΠΌΠΈΠ½. Π² ΡΠ΅ΠΆΠΈΠΌΠ΅ 30 ΡΠ΅ΠΊ. Π²ΠΊΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΎ, 30 ΡΠ΅ΠΊ. Π²ΡΠΊΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΎ Π² Π»Π΅Π΄ΡΠ½ΠΎΠΉ Π±Π°Π½Π΅. Π Π°Π·ΡΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠ΅ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΡ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΠΊ ΡΠ΄Π°Π»ΡΠ»ΠΈ ΡΠ΅Π½ΡΡΠΈΡΡΠ³ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ 15 ΠΌΠΈΠ½., 10 000 Π΄, 4** Π‘ (Sorvall, RC-B5, Du Pont, Π‘Π¨Π). Π ΡΡΠΏΠ΅ΡΠ½Π°ΡΠ°Π½ΡΡ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 5 Π ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄Π° Π½Π°ΡΡΠΈΡ Π΄ΠΎ ΠΊΠΎΠ½Π΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ 0,8 Π ΠΈ 1/40 10% ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΠΏΠΎΠ»ΠΈΡΡΠΈΠ»Π΅Π½ΠΈΠΌΠΈΠ½Π° ΠΈ ΠΈΠ½ΠΊΡΠ±ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ 10 ΠΌΠΈΠ½. Π½Π° Π»ΡΠ΄Ρ. ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΡΠ΄Π°Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΎΡΠ°Π΄ΠΊΠ° Π½Π°ΡΡΡΠ΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΡΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ° Π°ΠΌΠΌΠΎΠ½ΠΈΡ (ΡΠ 7) ΠΈ Π²ΡΠ΄Π΅ΡΠΆΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ 30 ΠΌΠΈΠ½. Π½Π° Π»ΡΠ΄Ρ. ΠΡΠ°Π΄ΠΎΠΊ ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π΄Π»Ρ Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΠ°, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅Π³ΠΎ 5 ΠΌΠ ΠΈΠΌΠΈΠ΄Π°Π·ΠΎΠ»Π° ΠΈ 0,1 ΠΌΠ ΡΠ΅Π½ΠΈΠ»ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»ΡΡΠ»ΡΡΠΎΠ½ΠΈΠ»ΡΠ»ΡΠΎΡΠΈΠ΄Π°, Π½Π΅ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΡΠ½Π½ΡΠ΅ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΡ ΡΠ΄Π°Π»ΡΠ»ΠΈ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ Π΄Π»Ρ Π°ΡΠΈΠ½Π½ΠΎΠΉ Ρ
ΡΠΎΠΌΠ°ΡΠΎΠ³ΡΠ°ΡΠΈΠΈ Π½Π° N1^ «^ - Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΠΎΠΌ ΡΠΎΡΠ±Π΅Π½ΡΠ΅ (Quiagen). ΠΠ»Ρ ΠΏΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΠΈ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ 1 ΠΌΠ» ΡΡΡΠΏΠ΅Π½Π·ΠΈΠΈ Ni^*- Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Ρ Π² 50% ΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π΅, ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΡ ΠΏΠΎΠΌΠ΅ΡΠ°Π»ΠΈ Π² ΠΏΡΡΡΡΡ Ρ
ΡΠΎΠΌΠ°ΡΠΎΠ³ΡΠ°ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΡΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ Poly-Prep (Bio-Rad, Π‘Π¨Π, Π½ΠΎΠΌΠ΅Ρ ΠΏΠΎ ΠΊΠ°ΡΠ°Π»ΠΎΠ³Ρ 731−1550), ΠΏΠΎΡΠ»Π΅ ΡΠ΅Π³ΠΎ ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΡΠ»ΠΈ ΡΠΎΡΠ±Π΅Π½ΡΡ ΠΎΡΠ΅ΡΡΡ ΠΏΡΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΠΊΠ°Π½ΠΈΠΈ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΠΏΠΎΠ΄ Π΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΠ΅ΠΌ ΡΠΈΠ»Ρ ΡΡΠΆΠ΅ΡΡΠΈ. Π ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ΅ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ°Π»ΠΈ ΠΎΠΊΠΎΠ»ΠΎ 0,6 ΠΌΠ» ΡΡΠΎΡΠΌΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π½ΠΎΡΠΈΡΠ΅Π»Ρ. ΠΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΠΏΡΠΎΠΌΡΠ²Π°Π»ΠΈ 2 ΠΌΠ» (Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ 3 ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠΎΠ²) Π²ΠΎΠ΄Ρ, 3 ΠΌΠ» (Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ 5 ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠΎΠ²) 50 ΠΌΠ ΡΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ° Π½ΠΈΠΊΠ΅Π»Ρ (Π΄Π»Ρ Π΄ΠΎΡΡΠΈΠΆΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΌΠ°ΠΊΡΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ ΡΠΌΠΊΠΎΡΡΠΈ) ΠΈ 2 ΠΌΠ» Π²ΠΎΠ΄Ρ. ΠΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΡΡΠ°Π²Π½ΠΎΠ²Π΅ΡΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ 2 ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π΄Π»Ρ Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΠ°, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅Π³ΠΎ 5 ΠΌΠ ΠΈΠΌΠΈΠ΄Π°Π·ΠΎΠ»Π°. ΠΡΡΡΠ²ΡΠΉ ΠΎΠ±ΡΡΠΌ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΠΈ ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ» ΠΎΠΊΠΎΠ»ΠΎ 200 ΠΌΠΊΠ» (Π± ΠΊΠ°ΠΏΠ΅Π»Ρ). ΠΠΎΡΠ»Π΅ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠΏΠ΅ΡΠ½Π°ΡΠ°Π½ΡΠ° ΡΠΎΠ±ΠΈΡΠ°Π»ΠΈ ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΈ Π² ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠ΅ 1,5 ΠΌΠ». ΠΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ ΠΏΡΠΎΠΌΡΠ²Π°Π»ΠΈ Π±ΡΡΠ΅ΡΠΎΠΌ Π΄Π»Ρ Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΠ°, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΌ ΠΈΠΌΠΈΠ΄Π°Π·ΠΎΠ» Π² Π²ΠΎΠ·ΡΠ°ΡΡΠ°ΡΡΠΈΡ
ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΡΡ
: 5 ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Ρ 20 ΠΌΠ ΠΈΠΌΠΈΠ΄Π°Π·ΠΎΠ»Π°, 1 ΠΌΠ» Ρ 60 ΠΌΠ ΠΈ 3 ΠΌΠ» Ρ 200 ΠΌΠ. Π‘ΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°Π½ΠΈΠ΅ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΠΏΡΠΎΠ²Π΅ΡΡΠ»ΠΈ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠΎΠ² ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΉ Π½Π° Π³Π΅Π»Ρ Ρ ΠΠ‘Π, ΠΠ±ΡΡΠ½ΠΎ ΠΏΠΈΠΊ ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°Π»ΡΡ Π² Π΄Π²ΡΡ
ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄Π½ΠΈΡ
ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΡΡ
. ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠΉ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΈΠ»ΠΈ Vivaspin 50 000 MWCO (Vivascience, ΠΠ΅ΡΠΌΠ°Π½ΠΈΡ). ΠΠΎ Π²ΡΠ΅ΠΌΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΡΠΌΠ΅Π½Ρ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π° Π±ΡΡΠ΅Ρ Π΄Π»Ρ Ρ
ΡΠ°Π½Π΅Π½ΠΈΡ (40 ΠΌΠ ΡΡΠΈΡ-ΠΠ‘1 (ΡΠ 7.9), 100 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ Π½Π°ΡΡΠΈΡ, 5 ΠΌΠ Ρ-ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», 1 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π, 4% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½). ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ ΠΊ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΡ Π±Π΅Π»ΠΊΠ° Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½ Π΄ΠΎ ΠΊΠΎΠ½Π΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΠΈ 50%. ΠΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΡ Π±Π΅Π»ΠΊΠ° ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»ΡΠ»ΠΈ ΡΠΏΠ΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠΎΠΌΠ΅ΡΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈ ΠΏΡΠΈ Π΄Π»ΠΈΠ½Π΅ Π²ΠΎΠ»Π½Ρ 280 Π½ΠΌ, ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΡ ΠΊΠΎΡΡΡΠΈΡΠΈΠ΅Π½Ρ ΡΠΊΡΡΠΈΠ½ΠΊΡΠΈΠΈ 1,4 Ρ
ΠΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π’7 Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ ΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΎΠ±ΠΌΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ Ρ
ΡΠΎΠΌΠ°ΡΠΎΠ³ΡΠ°ΡΠΈΠΈ ΠΡΠΈ Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠΈ ΠΌΡΡΠ°Π½ΡΠ½ΡΡ
Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ², Π½Π΅ ΠΌΠΎΠ΄ΠΈΡΠΈΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΡΡ
Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΠΎΡΡΠ°ΡΠΊΠΎΠ² Π³ΠΈΡΡΠΈΠ΄ΠΈΠ½Π°, ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ ΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΎΠ±ΠΌΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ Ρ
ΡΠΎΠΌΠ°ΡΠΎΠ³ΡΠ°ΡΠΈΠΈ. ΠΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΡΡ
ΠΊΡΠ»ΡΡΡΡ, ΠΈΠ½Π΄ΡΠΊΡΠΈΡ ΠΈ ΠΎΠ·Π²ΡΡΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΊΠ°ΠΊ ΠΎΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΎ Π²ΡΡΠ΅. ΠΠΎΡΠ»Π΅ ΠΏΠ΅ΡΠ΅ΠΎΡΠ°ΠΆΠ΄Π΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠΎΠΌ Π°ΠΌΠΌΠΎΠ½ΠΈΡ ΠΎΡΠ°Π΄ΠΎΠΊ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΡΠ»ΠΈ Π² 4 ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π 11 (20 ΠΌΠ ΡΠΎΡΡΠ°Ρ Π½Π°ΡΡΠΈΡ (ΡΠ 7.7), 50 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ Π½Π°ΡΡΠΈΡ, 2 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π, 0,1 ΠΌΠ ΡΠ΅Π½ΠΈΠ»ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»ΡΡΠ»ΡΡΠΎΠ½ΠΈΠ»ΡΠ»ΡΠΎΡΠΈΠ΄, 5 ΠΌΠ Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», 5 ΠΌΠ 5% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½) ΠΈ Π΄Π΅Π°Π»ΠΈΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠΈΠ² 100 ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠΎΠ² ΡΡΠΎΠ³ΠΎ ΠΆΠ΅ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° ΠΏΠΎΠ΄Π³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½Π½ΡΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ Ρ ΡΠΎΡΡΠΎΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·ΠΎΠΉ Π 11 (Whatman, Π‘Π¨Π). Π‘ΠΎΡΠ±Π΅Π½Ρ ΠΎΠ±ΡΠ°Π±Π°ΡΡΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΠΎΠ³Π»Π°ΡΠ½ΠΎ ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ΅Π½Π΄Π°ΡΠΈΠΈ ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΡΠ΅Π»Ρ. 2 ΠΌΠ» ΡΡΡΠΏΠ΅Π½Π΄ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠΉ ΡΠΎΡΡΠΎΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ ΠΏΠΎΠΌΠ΅ΡΠ°Π»ΠΈ Π² ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ Poly-Prep (Bio-Rad) ΠΈ ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΡΠ»ΠΈ ΡΠΎΡΠ±Π΅Π½ΡΡ ΠΎΡΠ΅ΡΡΡ ΠΏΡΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΠΊΠ°Π½ΠΈΠΈ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΠΏΠΎΠ΄ Π΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΠ΅ΠΌ ΡΠΈΠ»Ρ ΡΡΠΆΠ΅ΡΡΠΈ. Π ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ΅ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ°Π»ΠΈ ΠΎΠΊΠΎΠ»ΠΎ 1 ΠΌΠ» ΡΡΠΎΡΠΌΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π½ΠΎΡΠΈΡΠ΅Π»Ρ. ΠΡΡΡΠ²ΡΠΉ ΠΎΠ±ΡΡΠΌ ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ» ΠΎΠΊΠΎΠ»ΠΎ 300 ΠΌΠΊΠ» (7 ΠΊΠ°ΠΏΠ΅Π»Ρ). ΠΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΡΡΠ°Π²Π½ΠΎΠ²Π΅ΡΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ 5 ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π 11. ΠΠΎΡΠ»Π΅ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π΄ΠΈΠ°Π»ΠΈΠ·Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° Π½Π° ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΡΠΎΠ±ΠΈΡΠ°Π»ΠΈ ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΏΠΎ 1,5 ΠΌΠ». ΠΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΠΏΡΠΎΠΌΡΠ²Π°Π»ΠΈ 5 ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π 11. ΠΠ΅Π»ΠΎΠΊ ΡΠ»ΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π² ΡΠ΅ΡΡΡΡΡ
ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΡΡ
ΠΏΠΎ 1 ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π΄Π»Ρ ΡΠ»ΡΡΠΈΠΈ (Π±ΡΡΠ΅Ρ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΉ 200 ΠΌΠ ΡΠΎΡΡΠ°Ρ Π½Π°ΡΡΠΈΡ (ΡΠ 7.7) ΠΈ 400 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ Π½Π°ΡΡΠΈΡ). ΠΠΈΠΊΠΎΠ²ΡΠ΅ ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»ΡΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ Π΄Π΅Π½Π°ΡΡΡΠΈΡΡΡΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π² Π³Π΅Π»Π΅. Π ΠΎΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΡΠ½Π½ΡΠΌ ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΡΠΌ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 15 ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠΎΠ² Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π΄ΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½ΠΈΡ (12,5 ΠΌΠ ΡΠΎΡΡΠ°Ρ Π½Π°ΡΡΠΈΡ (ΡΠ 7.7), 25 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ Π½Π°ΡΡΠΈΡ, 5 ΠΌΠ Ρ-ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», 5 ΠΌΠ 5%.
Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½). ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠΉ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡ Π½Π°Π½ΠΎΡΠΈΠ»ΠΈ Π½Π° ΠΏΠΎΠ΄Π³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½Π½ΡΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ Ρ DE52 (Whatman, Π‘Π¨Π). ΠΠΈΡΡΠΈΠ»Π°ΠΌΠΈΠ½ΠΎΡΡΠΈΠ»ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Π½ΡΠΉ ΡΠΎΡΠ±Π΅Π½Ρ ΠΎΠ±ΡΠ°Π±Π°ΡΡΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΠΎΠ³Π»Π°ΡΠ½ΠΎ ΡΠ΅ΠΊΠΎΠΌΠ΅Π½Π΄Π°ΡΠΈΠΈ ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΠΈΡΠ΅Π»Ρ. 2 ΠΌΠ» ΡΡΡΠΏΠ΅Π½Π΄ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΡΠ±Π΅Π½ΡΠ° ΠΏΠΎΠΌΠ΅ΡΠ°Π»ΠΈ Π² ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ Poly-Prep (Bio-Rad) ΠΈ ΠΏΠΎΠ·Π²ΠΎΠ»ΡΠ»ΠΈ ΡΠΎΡΠ±Π΅Π½ΡΡ ΠΎΡΠ΅ΡΡΡ ΠΏΡΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ΅ΠΊΠ°Π½ΠΈΠΈ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΠΏΠΎΠ΄ Π΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΠ΅ΠΌ ΡΠΈΠ»Ρ ΡΡΠΆΠ΅ΡΡΠΈ. Π ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ΅ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ°Π»ΠΈ ΠΎΠΊΠΎΠ»ΠΎ 1 ΠΌΠ» ΡΡΠΎΡΠΌΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π½ΠΎΡΠΈΡΠ΅Π»Ρ. ΠΡΡΡΠ²ΡΠΉ ΠΎΠ±ΡΡΠΌ ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ» ΠΎΠΊΠΎΠ»ΠΎ 300 ΠΌΠΊΠ» (7 ΠΊΠ°ΠΏΠ΅Π»Ρ). ΠΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΡΡΠ°Π²Π½ΠΎΠ²Π΅ΡΠΈΠ²Π°Π»ΠΈ 5 ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ DE52 (25 ΠΌΠ ΡΠΎΡΡΠ°Ρ Π½Π°ΡΡΠΈΡ (ΡΠ 7.7), 50 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ Π½Π°ΡΡΠΈΡ, 5 ΠΌΠ Ρ-ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», 5 ΠΌΠ 5% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½).ΠΠΎΡΠ»Π΅ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΡΠ° ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΠΏΡΠΎΠΌΡΠ²Π°Π»ΠΈ 5 ΠΌΠ» Π±ΡΡΠ΅ΡΠ° Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ DE52, ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΈ ΡΠΎΠ±ΠΈΡΠ°Π»ΠΈ Π² ΠΎΠ±ΡΡΠΌΠ΅ 1,5 ΠΌΠ». Π‘Π²ΡΠ·Π°Π½Π½ΡΠΉ Π±Π΅Π»ΠΎΠΊ ΡΠ»ΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ Π±ΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΌ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠΎΠΌ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΌ 25 ΠΌΠ ΡΠΎΡΡΠ°Ρ Π½Π°ΡΡΠΈΡ (ΡΠ 7.7), 125 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ Π½Π°ΡΡΠΈΡ, 5 ΠΌΠ Ρ-ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», 5 ΠΌΠ 5% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½. ΠΠΈΠΊΠΎΠ²ΡΠ΅ ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΎΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½ΡΠ»ΠΈ ΠΈ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ, ΠΊΠ°ΠΊ ΠΎΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΎ Π²ΡΡΠ΅. ΠΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ GAL4-T7 Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ ΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΎΠ±ΠΌΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ Ρ
ΡΠΎΠΌΠ°ΡΠΎΡΠ°ΡΠΈΠΈ ΠΡΠΈ Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΠΈ Π΄Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π±Π΅Π»ΠΊΠ° ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ ΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΎΠ±ΠΌΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ Ρ
ΡΠΎΠΌΠ°ΡΠΎΠ³ΡΠ°ΡΠΈΠΈ Π½Π° ΡΠΎΡΡΠΎΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Π΅. ΠΡΠΈΠ³ΠΎΡΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΎΡΠ½ΡΡ
ΠΊΡΠ»ΡΡΡΡ, ΠΈΠ½Π΄ΡΠΊΡΠΈΡ ΠΈ ΠΎΠ·Π²ΡΡΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΠΈΠ»ΠΈ ΠΊΠ°ΠΊ ΠΎΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΎ Π²ΡΡΠ΅ Π΄Π»Ρ Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΈΡ Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ ΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΎΠ±ΠΌΠ΅Π½Π½ΠΎΠΉ Ρ
ΠΎΠΌΠ°ΡΠΎΠ³ΡΠ°ΡΠΈΠΈ. Π ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΈΠΊΡ Π΄Π°Π»Π΅Π΅ Π²Π½Π΅ΡΠ΅Π½Ρ ΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠΈΠ΅ ΠΈΠ·ΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ΠΈΡ. ΠΡΠΈ ΠΏΠ΅ΡΠ΅ΠΎΡΠ°ΠΆΠ΄Π΅Π½ΠΈΠΈ ΡΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠΎΠΌ Π°ΠΌΠΌΠΎΠ½ΠΈΡ Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»ΡΠ»ΠΈ 3/5 ΠΎΠ±ΡΠ΅ΠΌΠ° Π½Π°ΡΡΡΠ΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠ° ΡΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ° Π°ΠΌΠΌΠΎΠ½ΠΈΡ, Π·Π°ΡΠ΅ΠΌ Π²ΡΠ΅ ΠΏΡΠΎΡΠ΅Π΄ΡΡΡ Π²ΡΠΏΠΎΠ»Π½ΡΠ»ΠΈΡΡ ΠΊΠ°ΠΊ ΠΎΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΎ Π²ΡΡΠ΅. ΠΡΡΠ΅Ρ Π΄Π»Ρ Π½Π°Π½Π΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π½Π° ΡΠΎΡΡΠΎΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Π½ΡΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΡ ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°Π» 20 ΠΌΠ ΡΠΎΡΡΠ°Ρ Π½Π°ΡΡΠΈΡ (ΡΠ 7.7), 200 ΠΌΠ Ρ
Π»ΠΎΡΠΈΠ΄ Π½Π°ΡΡΠΈΡ, 2 ΠΌΠ ΠΠΠ’Π, 0,1 ΠΌΠ ΡΠ΅Π½ΠΈΠ»ΠΌΠ΅ΡΠΈΠ»ΡΡΠ»ΡΡΠΎΠ½ΠΈΠ»ΡΠ»ΡΠΎΡΠΈΠ΄, 5 ΠΌΠ Ρ-ΠΌΠ΅ΡΠΊΠ°ΠΏΡΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ», 5 ΠΌΠ 5% Π³Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΈΠ½. ΠΠ»Ρ ΠΏΡΠΎΠΌΡΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΊΠΎΠ»ΠΎΠ½ΠΊΠΈ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΡΡΠΎΡ ΠΆΠ΅ Π±ΡΡΠ΅Ρ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΉ 80 ΠΌΠ ΡΠΎΡΡΠ°ΡΠ° Π½Π°ΡΡΠΈΡ. Π Π±ΡΡΠ΅ΡΠ΅ Π΄Π»Ρ ΡΠ»ΡΡΠΈΠΈ ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΡ ΡΠΎΡΡΠ°ΡΠ° Π½Π°ΡΡΠΈΡ ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ»Π° 400 ΠΌΠ. ΠΠΈΠΊΠΎΠ²ΡΠ΅ ΡΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΈ ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»ΡΠ»ΠΈ, ΠΊΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π»ΠΈ ΠΈ Ρ
ΡΠ°Π½ΠΈΠ»ΠΈ, ΠΊΠ°ΠΊ ΠΎΠΏΠΈΡΠ°Π½ΠΎ Π²ΡΡΠ΅. ΠΠΎΠ½ΡΠ΅Π½ΡΡΠ°ΡΠΈΡ Π±Π΅Π»ΠΊΠ° ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»ΡΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ Π΄Π΅Π½Π°ΡΡΡΠΈΡΡΡΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° ΠΏΡΠΎΡΠΈΠ² ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΡΠ°Π½Π΄Π°ΡΡΠ° Π ΠΠ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠΌΠ΅ΡΠ°Π·Ρ.