7. ВЫВОДЫ.
1. Развит новый метод, позволяющий изучать параметры коррелированного поиска мишеней в ДНК ферментами репарации с использованием величины вероятности коррелированного расщепления (Рсс) субстратов, содержащих два фермент-специфических сайта. Показано, что метод применим для исследования коррелированного поиска мишеней как в одноцепочечной, так и в двуцепочечной ДНК.
2. Показано различное влияние ионов Mg2+ и К+ на эффективность коррелированного поиска мишеней в двуцепочечной ДНК урацил-ДНК-гликозилазой Ung из Е. coli, объясняемое разной способностью этих ионов образовывать с ДНК координационные связи и экранировать отрицательный заряд ДНК. Установлено отсутствие значительного влияния эффекта вытесненного объема, одноцепочечных разрывов и брешей различной длины на величину PceПоказано значительное влияние ДНК-связывающих белков в клеточных экстрактах на величину Рсс урацил-ДНК-гликозилазы.
3. Исследовано влияние N-концевого фрагмента ядерной изоформы урацил-ДНК-гликозилазы человека (UNG) на эффективность коррелированного поиска мишеней этим ферментом. При низкой ионной силе N-концевой фрагмент уменьшает значения Рсс, а при оптимальной концентрации соли — увеличивает их, что может быть связано с увеличением сродства полноразмерной формы UNG к ДНК за счёт положительного заряда N-концевого фрагмента.
4. Показано, что АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) и Е. coli (Nfo) способны к коррелированному расщеплению ДНК-субстратов, причем значения Рсс при концентрациях KCl, близких к физиологическим (100−200 мМ), достигают 0,20,5, что указывает на возможность реализации АП-эндонуклеазами коррелированного поиска in vivo.
5. При помощи теории Белоцерковского-Зарлинга, описывающей процесс одномерной диффузии белков по ДНК, оценены параметры поиска мишеней ферментом Ung: характерная дистанция коррелированного поиска (100 пар нуклеотидов), вероятность отражения от концов линейного субстрата (0,83), константа скорости транслокации (2×10б с-1) и константа скорости диссоциации комплекса белок-ДНК при расположении фермента на конце линейной ДНК (4×105 с-1). Установлено, что хоппинг вносит значительный вклад в коррелированный поиск мишеней ферментом и^, при этом характерная дистанция слайдинга составляет 8−9 пар нуклеотидов.
6.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
В настоящей работе развит новый биохимический подход для изучения механизмов поиска специфических мишеней ферментами репарации. В отличие от ранее существующих биохимических методов изучения механизмов поиска специфических мишеней белковыми факторами, подход позволяет четко контролировать структуру используемого субстрата и вводить в субстрат сайты расщепления практически любой химической природы или распознаваемые изучаемым белком последовательности ДНК, а также модифицировать структуру ДНК между ними, что делает метод применимым для изучения механизмов транслокации широкого спектра ДНК-зависимых белковых факторов, а не только ферментов репарации. Метод позволяет, исходя из легко измеряемой в эксперименте зависимости величины вероятности коррелированного расщепления субстрата (Рсс) от расстояния между фермент-специфическими сайтами, определить кинетические параметры транслокации ДНК-зависимых белков вдоль двойной цепи при помощи вариации расстояния между фермент-специфическими сайтами, используя теорию Белоцерковского-Зарлинга [165] для обработки результатов. Возможна также разработка и использование совмесно с данным подходом альтернативных теоретических описаний для получения количественных параметров процесса поиска мишеней. Кроме того, метод также позволяет изучать коррелированный поиск на одноцепочечном субстрате, чего нельзя было сделать при помощи существующих биохимических подходов. С помощью предложенного метода в настоящей работе исследован механизм поиска мишеней урацил-ДНК-гликозилазами Е. coli (Ung) и человека (UNG), а также АП-эндонуклеазами Е. coli (Nfo) и человека (АРЕХ1), причем для ферментов UNG и Nfo такой анализ проведен впервые.
В настоящей работе впервые представлен анализ влияния на коррелированный поиск ионов Mg2+ в сопоставлении с ионами К+, эффекта вытесненного объема, а также дополнительной не участвующей в каталитическом акте аминокислотной последовательности полноразмерной формы урацил-ДНК-гликозилазы человека. Изучено также влияние брешей различной длины в ДНК на вероятность коррелированного расщепления.
1. Barnabas J., Schwartz R.M., Dayhoff M.O. Evolution of major metabolic innovations in the Precambriaa //Orig. Life- 1982. -V. 12. -№ 1. -p. 81−91.
2. Lindahl Т., Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. // Biochemistry 1972. -V. 11. -№ 19.-p. 3610−3618.
3. Atamna H., Cheung I., Ames B.N. A method for detecting abasic sites in living cells: age-dependent changes in base excision repair. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. -V. 97,-№ 2.-p. 686−691.
4. Кочетков H.K., Будовский Э. И., Свердлов Е. Д., Симукова Н. А., Турчинский М. Ф., Шибаев В. Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. Москва: Химия, 1970. -486 с.
5. Shearman C.W., Loeb L.A. Depurination decreases fidelity of DNA synthesis in vitro. H Nature 1977. — V. 270. — № 5637. — p. 537−538.
6. Schaaper R.M., Kunkel T.A., Loeb L.A. Infidelity of DNA synthesis associated with bypass of apurinic sites. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1983. — V. 80. — № 2. — p. 487 491.
7. Goodman M.F., Cai H., Bloom L.B., Eritja R. Nucleotide insertion and primer extension at abasic template sites in different sequence contexts. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1994. -V. 726.-p. 132−142.
8. Cuniasse P., Fazakerley G.V., Guschlbauer W., Kaplan B.E., Sowers L.C. The abasic site as a challenge to DNA polymerase. A nuclear magnetic resonance study of G, С and T opposite a model abasic site. // J. Mol. Biol. 1990. — V. 213. — № 2. — p. 303−314.
9. Gestl E.E., Eckert K.A. Loss of DNA minor groove interactions by exonuclease-deficient Klenow polymerase inhibits 06-methylguanine and abasic site translesion synthesis. // Biochemistry 2005. — V. 44. — № 18. — p. 7059−7068.
10. Kokoska R.J., McCulloch S.D., Kunkel T.A. The efficiency and specificity of apurinic/apyrimidinic site bypass by human DNA polymerase r and Sulfolobus solfataricus Dpo4. // J. Biol. Chem. 2003. — V. 278. — № 50. — p. 50 537−50 545.
11. Pages V., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S. Mutational specificity and genetic control of replicative bypass of an abasic site in yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. -V. 105.-№ 4.-p. 1170−1175.
12. Chen Y.-H., Bogenhagen D.F. Effects of DNA lesions on transcription elongation by T7 RNA polymerase. // J. Biol. Chem. 1993. — V. 268. — № 8. — p. 5849−5855.
13. Lindahl Т., Andersson A. Rate of chain breakage at apurinic sites in double-stranded deoxyribonucleic acid. //Biochemistry- 1972. -V. 11. -№ 19. -p. 3618−3623.
14. Василенко H.JI., Невинский Г. А. Пути накопления и репарации остатков дезоксиуридина в ДНК клеток низших и высших организмов. // Биохимия 2003. -Т. 68,-№ 2.-с. 165−183.
15. Frederico L.A., Kunkel Т.А., Shaw B.R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. // Biochemistry 1990. — V. 29. -№ 10. — p. 2532−2537.
16. Туе B.-K., Chien J., Lehman I.R., Duncan B.K., Warner H.R. Uracil incorporation: a source of pulse-labeled DNA fragments in the replication of the Escherichia coli chromosome. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1978. — V. 75. — № 1. — p. 233−237.
17. David S.S., Williams S.D. Chemistry of glycosylases and endonucleases involved in base-excision repair. // Chem. Rev. 1998. — V. 98. — № 3. — p. 1221−1261.19,20.21,22,23,24,25.