Взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов при прорастании семян пшеницы

Семенам дикорастущих и культурных растений свойственно состояние вынужденного покоя. Такие семена при неблагоприятных условиях не прорастают совсем или имеют пониженную всхожесть. В этом случае способность семян находиться в состоянии покоя обеспечивает растениям возможность переживать неблагоприятные для их существования периоды года [1]. Однако с возрастанием оводненности в семенах активируются основные метаболические процессы, и повышается дыхание до максимального уровня, характеризующие их рост и развитие [2]. Период прорастания семян делится на три этапа: 1) активация метаболизма (этап физического набухания семян) — 2) подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша) — 3) собственно рост органов проростка [3].

Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, который может вызывать окислительное повреждение тканей. В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода: 02 02 Н202, НО-, НОС1 и др. [4]. Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран. Супероксидные радикалы модифицируют белки, нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие, функционально активные вещества. Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей [5]. В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава и проницаемости мембран и ряда биосинтетических процессов. Контроль над содержанием АФК в семенах осуществляют антиоксиданты [6].

При прорастании семян в них генерируются активные формы кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы в составе низкои высокомолекулярных соединений. К группе низкомолекулярных антиоксидантов относятся аминокислоты, дигоксин, аскорбиновая кислота, гидрохинон, мочевая кислота, мелатонин, глутатион и др. В комплекс высокомолекулярной системы антиоксидантной защиты входят ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др. Действие компонентов системы антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях [7]. Однако роль антиоксидантов в механизмах покоя и прорастания семян пшеницы мало изучена. Хотя известно, что многие из низкомолекулярных антиоксидантов могут быть субстратами пероксидазы [8].

Являясь компонентами единой антиоксидантной системы растений, низкои высокомолекулярные антиоксиданты способны оказывать взаимное влияние. Например, низкомолекулярные антиоксиданты (аскорбиновая кислота, кверцетин, гидрохинон и др.) служат субстратами пероксидазы и окисляются ферментом в реакциях индивидуального и совместного окисления. Тогда как их высокие концентрации способны ингибировать фермент. Однако механизм этого взаимодействия недостаточно изучен [9].

Высокая активность пероксидазы в семенах и проростках пшеницы позволяет предположить об участии фермента в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы, активность которой определяет их уровень устойчивости к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза растений. Фермент способен катализировать окисление различных неорганических и органических соединений. Обладая широкой субстратной специфичностью, фермент может проявлять свойства оксидазы [10]. Поэтому активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя. Однако мало изучена роль пероксидазы в механизме действия антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы и не раскрыта роль низкомолекулярных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.

Актуальность и значимость изучения антиоксидантной системы защиты растений в процессе прорастания позволили нам сформулировать цель данной диссертации.

Цель работы состояла в изучении роли антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы, установления закономерностей проявления ее реактивности на действие низких температур и биологически активных веществ, а также в раскрытии роли пероксидазы и антиоксидантов в механизмах формирования покоя семян пшеницы.

Научная новизна. Показано, что пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты осуществляется, если с окисленными формами пероксидазы (Е1 и Е2) связываются одна или две молекулы аскорбиновой кислоты. При связывании двух молекул субстрата наблюдается активирование фермента, тогда как связывание нескольких молекул субстрата ингибирует пероксидазу. Установлено, что при совместном присутствии, аскорбиновая кислота и гидрохинон окисляются последовательно. Гидрохинон активирует окисление аскорбиновой кислоты, тогда как её избыток ингибирует пероксидазу. Показано, что антиоксиданты и пероксидаза входят в единую систему антиоксидантной защиты растений, где выполняют строго специализированные функции.

Пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, контролирует уровень перекиси водорода и антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а антиоксиданты накапливаясь в тканях, участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, кроме этого могут регулировать активность пероксидазы, осуществляя, таким образом, общий контроль над деятельностью системы антиоксидантной защиты. Предложен механизм формирования покоя семян заключающийся в том, что антиоксиданты в высоких концентрациях понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть. Практическое значение. Установлено, что, насыщая зерна ксенобиотиками, можно добиваться повышения их посевных качеств, а также сопротивляемости зерен и растений к экзогенным патогенным факторам. Полученные данные позволяют предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах функционально активных веществ, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа набухания. Замачивание семян на это время не принесет им существенного вреда и не повлияет на посевные качества. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в течение первых двух часов будет способствовать повышению их всхожести. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для повышения сопротивляемости семян и проростков пшеницы к действию неблагоприятных факторов среды и увеличению их урожайности.

Данные полученные при изучении влияния различных химических соединений на физиолого-биохимические показатели семян пшеницы могут быть использованы при оценке их токсического действии на живые организмы. На примере пероксидазного окисления аминазина, викасола, дигоксина, норадреналина показана целесообразность использования пероксидазы, как модельного гемсодержащего белка, аналоги которого широко представлены в организме человека и животных, для изучения метаболизма лекарственных препаратов в условиях in vitro. Приведенные в работе исследования по кинетике совместного пероксидазного окисления субстратов пероксидазы позволяют разобраться в строении и механизме действия фермента.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА I. Антиоксиданты растений.

Антиоксидантная система представляет собой совокупность специально адаптированных ферментов и различных низкомолекулярных соединений, основной функцией которых является защита клетки от токсического действия свободных радикалов [11].

Энергетическое жизнеобеспечение клеток поддерживается достаточно сложным комплексом процессов, среди которых главное место отводится окислительно-восстановительным реакциям, использующим Ог как основной окислитель, акцептора электронов [4]. Несмотря на высокую специфичность основных метаболических реакций в клетках наблюдается образование продуктов неполного восстановления кислорода (02 Н202, ОН, Ог1) и окислительных реакций (перекисей, диеновых конъюгатов, альдегидов и кетонов) [11]. Поэтому проблема кислородной токсичности у растений стоит наиболее остро, так как клетки растений не только потребляют кислород, но и образуют его в процессе своей жизнедеятельности [12].

Присоединение одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии приводит к образованию супероксидного анион-радикала (О2), который при взаимодействии с протоном переходит в гидроперекисный радикал (Н02~), представляющий собой слабую кислоту с Кд 4,8 в физиологических условиях [13]. 02″ - более реакционноспособное соединение, чем 02. Время его жизни в биологических субстратах 10″ 6 с, при радиусе диффузии 0,3 мкм [11]. 02″ имеет заряд, поэтому он плохо мигрирует через мембраны в отличие от Н02″ [14]. 02″ - относительно слабый окислитель. В живых системах 02″ представляет собой промежуточный продукт многих биохимических реакций — таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, а также метаболизма ксенобиотиков, поэтому во многих биологических системах супероксид радикал выступает в качестве донора электронов. Однако основными источниками его образования являются ферментативные системы: НАДФНоксидаза — ферментативный комплекс, специализирующийся на восстановлении О2 с образованием О2″ - НАДФН флавопротеин убихинон цитохром Ь558 -" О2- ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром с-оксидаза и микросомальные монооксигеназы [6, 15−18]. Образование О2″ сопутствует ряду реакций, катализируемых пероксидазой [19].

Возникновение О2″ в результате активации НАДФН-оксидазы играет важную роль в реализации их микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия [20, 21]. При этом в физиологических.

3~ь 21 условиях О2″ восстанавливает Бе до Бе, участвуя, таким образом, в реакции Фентона, приводящей к образованию реакционного радикала ОН" [5].

Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону Ог" сопровождается образованием двухзарядного аниона 02 В свободном состоянии такой анион не существует, так как энергия связывания атомов кислорода становится отрицательной [15]. Присоединяя протоны, он переходит в Н02″ или Н2Ог, при этом при физиологических значениях рН преобладает Н202 [6]. Перекись водорода относят к окислителям средней силыв отсутствие каталазы, пероксидазы и ионов металлов переменной валентности она относительно стабильна и может мигрировать в клетки и ткани [15]. В организме Н202 образуется в реакциях катализируемых оксидазами (ксантиноксидазой, оксидазой Ь-аминокислот и др.), а также в реакциях дисмутации, катализируемых СОД [4] и при образовании лигнина [22].

Механизм участия Н202 в физиологических процессах растений в настоящее время серьезно изучается. Показано, что пероксид определяет интенсивность фотофосфорилирования, фотодыхания, фунгицидотоксичность поверхности листьев [23, 24]. Содержание перекиси водорода в растительных клетках широко варьируется в зависимости от условий внешней среды, возраста и некоторых других факторов [23]. Выдвинута гипотеза о том, что источником кислорода (водорода) при фотосинтезе является не вода, а пероксид водорода.

24]. Н202 служит источником возникновения ОН' [25].

Наиболее реакционноспособным из АФК является гидроксилъный радикал (ОН). Он может разрывать любую С-Н или С-С — связь. Скорость его взаимодействия с большинством органических соединений достигает величин, п 1Л равных скорости диффузии (10 — 10 моль/с), что приводит к очень малым значениям времени его жизни в биологических субстратах (2 10' «9 до 8 10″ 9 с [4, 26]), при этом радиус миграции радикала ОН» меньше 100 А, что сравнимо с размерами органических молекул.

Образование ОН" отмечено в реакциях окисления арахидоновой кислоты по реакции Габера — Вейса [27];

02″ + Н202 ОН + ОН + о2 и в реакциях микросомального окисления с участием флавиновых ферментов и СоС> [23]. Однако основным источником ОН' в большинстве биологических систем служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом Бе, по схеме:

Н202 + Ре2±> Бе3++ ОН" + ОН" Обратное восстановление Бе возможно в реакции с 02, аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином и другими легко окисляющимися соединениями [28].

Изменение спина одного из электронов, находящихся на 71-орбиталях в молекуле кислорода, приводит к образованию возбужденного синглетного состояния (Ог), энергия которого на 96,3 кДж/М больше энергии основного триплетного состояния. Возможно, также, образование (159,6 кДж/М) состояния, когда электроны находятся на разных орбиталях, однако из него.

1 12 молекула кислорода переходит в состояние Agзa 10″ с и поэтому практически.

1 1 зарегистрировать состояние не удается. 02 метастабилен, переход его в триплетное состояние сопровождается инфракрасной (1270 нм), а рекомбинация — красной (634 нм) люминесценцией. Высокая реакционная способность приводит к тому, что он легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями, принимает участие в инициировании ПОЛ и возникновении биохемилюминесценции [28, 29]. В связи с низким выходом кислорода в синглетном состоянии и малым временем его жизни в биологических субстратах (2 — 5 «10» 6с) концентрация 02* в клетках не превышает 10″ 6 М [30].

В качестве основного продукта синглетный кислород образуется в фотохимических реакциях, связанных с возбуждением пигментов (хлорофилл, ретиналь, флавины, порфирины). Вместе с тем во многих ферментативных реакциях с участием СОД, каталазы, пероксидазы, а также в реакциях с АФК отмечено возникновение О21 как сопутствующего продукта [31, 32].

В клетках живых организмов защиту от АФК, осуществляет специализированная антиоксидантная система в составе низкои высокомолекулярных антиоксидантов.

К группе низкомолекулярных антиоксидантов относятся аминокислоты, мочевина, гидрохинон, мелатонин, глутатион, аскорбиновая кислота, кверцетин, дигоксин, а к высокомолекулярным антиоксидантам — ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др.) и белки способные связывать металлы с переменной валентностью [7].

ВЫВОДЫ.

1. При набухании и прорастании семян пшеницы активность пероксидазы в семенах и проростках возрастает. Повышение уровня антиоксидантов сопровождается увеличением перекисного окисления липидов, а активность пероксидазы возрастает с уменьшением содержания антиоксидантов. В случае повышения уровня антиоксидантов отмечается понижение активности пероксидазы.

2. Низкие положительные температуры способствуют повышению активности пероксидазы и содержание антиоксидантов в зародыше семян пшеницы. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и кожуре.

3. Определены величины каталитических констант пероксидазы зерен пшеницы в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты. Кт по о-дианизидину незначительно отличается от константы Михаэлиса, определенной для очищенного препарата пероксидазы хрена выпускаемой фирмой «КеапаГ, тогда как Кт по аскорбиновой кислоте в 5−9 раз ниже показателей очищенного препарата. Такие различия можно объяснить за счет присутствия в гомогенате зерен посторонних субстратов пероксидазы, участвующих в совместном окислении аскорбиновой кислоты.

4. Контроль над уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксиданты, так и пероксидаза. Ведущую роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, а в корнях эта функция возложена на пероксидазу.

— 1735. При окислении аскорбиновой кислоты в присутствии пероксидазы, в механизме действия фермента заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. Константа связывания аскорбиновой кислоты с окисленными формами пероксидазы соизмерима с Кт быстроокисляемых органических субстратов фермента, поэтому предварительное связывание аскорбиновой кислоты с полуокисленными формами пероксидазы может препятствовать их пероксидазному окислению. При связывании двух молекул аскорбиновой кислоты процесс ее пероксидазного окисления ускоряется, а избыток аскорбиновой кислоты понижает каталитическую активность фермента. Данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.

6. Аскорбиновая кислота и гидрохинон являются медленно и быстро окисляемыми субстратами пероксидазы соответственно. При совместном присутствии в реакционной среде аскорбиновая кислота и гидрохинон, а также гидрохинон и о-дианизидин окисляются последовательно. Гидрохинон активирует окисление аскорбиновой кислоты, тогда как избыток аскорбиновой кислоты ингибирует фермент в реакции совместного окисления субстратов. Окисление о-дианизидина не наблюдалось до полного превращения гидрохинона. Установлено, что скорость пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии о-дианизидина может превышать скорость индивидуального окисления этих субстратов более чем в 10−100 раз.

7. Дигоксин, связываясь с фермент-субстратным комплексом, в котором присутствует стабильный полуокисленный продукт о-дианизидина, подавляет свободнорадикальное окисление о-дианизидина и ингибирует пероксидазу по антиконкурентному типу. Кверцетин, связываясь с ферментом, понижает сродство и эффективность превращения о-дианизидина. Ингибирует пероксидазу по смешанному типу.

— 175.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Изучение биохимических механизмов прорастания семян имеет общебиологическое значение. Исследование механизмов покоя и прорастания семян позволяет раскрыть закономерности формирования этих механизмов в растениях.

Использование антиоксидантов позволяет активизировать механизмы антиоксидантной защиты клеток растений от различных неблагоприятных воздействий факторов внешней среды. Являясь модуляторами биохимических процессов, антиоксиданты действуют, как неспецифические стимуляторы, осуществляя в живой клетке взаимосвязь свободнорадикальных и биохимических процессов. Антиоксиданты, регулируя в клетке процессы ПОЛ, могут оказывать влияние на клеточную пролиферацию посредством изменения состава липидов мембран, степени насыщенности ацильных цепей липидов, окисляемость липидов [6, 7, 11]. Исследование этих, взаимодействий является необходимым и важным этапом в изучении механизма действия антиоксидантов на клетки организма.

Практически отсутствуют сведения о роли антиоксидантной системы в формировании механизмов покоя, в регуляции содержания и активности антиоксидантов, а также об участии антиоксидантов в формировании механизмов вынужденного покоя.

В регуляции покоя и индукции прорастания семян важную роль играют негормональные регуляторы роста — фенольные соединения (кверцетин, салициловая кислота, кофейная кислота и другие производные фенолов), которые входят в состав J3 — ингибиторного комплекса [195]. Фенольные соединения и гормональные регуляторы роста относятся к группе низкомолекулярных антиоксидантов и являются истинными субстратами пероксидаз растений [8].

Для выхода семян из покоя необходимы акцепторы водорода: кислород, Н2С>2, нитраты и др., что послужило обоснованием гипотезы о выходе семян из покоя в результате реакции окисления, отличной от дыхания и осуществляемой НАДФН оксидазой [200, 201].

Среди ферментов принимающих активное участие в формировании механизмов покоя семян следует выделить пероксидазу, которая относится к классу окислительно-восстановительных ферментов, катализирующих окисление различных по структуре органических и неорганических соединений, в присутствии перекиси водорода. Предполагается, что в растениях происходит индуцибельный синтез пероксидазы в ответ на увеличение количества субстрата [8]. Окисление субстратов пероксидазой может осуществляться ферментом в пероксидазных и оксидазных реакциях.

Субстратами пероксидазы могут быть фенолы, ароматические амины, нитрит, цитохром С, аскорбат, индоламины и др [10, 110]. В случае оксидазного типа реакции субстратами являются ИУК, дигидроксифумарат, восстановленные триозы, НАДФ-Н2, нафтогидрохинон и др. 8]. Поскольку активность пероксидазы и метаболизм гормональных и негормональных соединений тесно взаимосвязаны, то повышение активности фермента должно отражать и изменения в метаболизме его субстратов. Очевидно, что в ходе онтогенеза образуются и накапливаются вещества, оказывающие не только стимулирующее, но и ингибирующее действие на различные физиолого-биохимические процессы. При чем один и тот же класс соединений может оказывать и то и другое влияние. Это соответствует представлению о том, что регуляторные механизмы живого организма весьма экономны, и один и тот же контур регуляции обычно используется для решения нескольких задач. Однако механизм действия веществ требует дальнейшего изучения [202].

Анализ литературных данных показал, что до сих пор нет достаточно полного объяснения роли пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в механизме действия антиоксидантной системы на конечных этапах эмбриогенеза. Поэтому актуальность и значимость участия антиоксидантной системы в формировании механизмов покоя и прорастания семян позволили нам сформулировать цель и задачи данной диссертации.

Цель и задачи исследования

: Цель настоящей работы состояла в изучении роли антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы, установления закономерностей проявления ее реактивности на действие низких положительных температур и биологически активных веществ, а также в раскрытии роли пероксидазы и антиоксидантов в механизмах формирования покоя семян пшеницы.

Поставленная цель определяла необходимость решения следующих задач:

1. Изучить количественные закономерности проявления пероксидазной активности в процессе набухания и прорастания семян пшеницы.

2. Исследовать количественные показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантов в проростках пшеницы.

3. Установить количественные закономерности проявления индивидуальной реактивности проростков на действие низких положительных температур

4. Изучить влияние антиоксидантов на каталитические свойства пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного окисления.

5. Выявить закономерности взаимного влияния низкои высокомолекулярных антиоксидантов, входящих в единую систему антиоксидантной защиты живых организмов.

6. Исследовать влияние экзогенных антиоксидантов на прорастание и всхожесть семян пшеницы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

§ 1. Исходные вещества.

Объектом исследования служили семена пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Омская 12.

Реактивы: пероксидаза хрена — фирмы «Reanal» (Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ = 1.0- аскорбиновая кислота — фирмы «Serva» (Германия) — норадреналин и викасол — концерна «Биопрепарат» (Россия) — кверцетин — фирмы «Serva» (Германия) — аминазин — концерна «Биопрепарат» (Россия) — о-фенантролин — фирмы «Serva» (Германия) — ТБК — ос.ч. (Реахим) — тритон Х-100 — препарат фирмы «Ferak Berlin» (Западный Берлин) — этанол очищали перегонкойо-дианизидин марки ч. очищали возгонкой в вакуумеперекись водорода — 30%-ный водный раствор, ос.ч. («Реахим», Россия) — НАД, НАДФ, глюкозо-6-фосфат фирмы «Reanal» (Венгрия). В работе использовали соли ос.ч. или дважды перекристаллизованные из бидистиллированной воды.

§ 2. Использованная аппаратура.

Для измерения рН растворов использовали лабораторный рН — метр, марки ОР-211/1 (Венгрия) с точностью до ±0,1 ед. рН. Калибровку прибора проводили стандартными буферными растворами.

Кинетические кривые окисления и спектральные характеристики регистрировали на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы «Varian» (США). Фотометрическая точность прибора составляла 1% от данной величины шкалы, точность установки длины волны 1 нм. Спектральные измерения производили в широком диапазоне оптической плотности, скорость сканирования 100 нм/мин, скорость движения самописца от 0,25 до ЗОсм/мин. Для поддержания заданной температуры использовали ультратермостат марки UTU-2/77 (Польша), с точностью ±-0,1°С. Растворы отбирали микропипетками фирмы «Gilson» (Франция) точность отбора 0,2%.

Взвешивание навесок анализируемых проб проводили на аналитических весах BJIKT-500-М (Россия), PRLT Т -4 (Польша).

Для индукции перекисного окисления липидов использовали ртутно-кварцевую лампу БНП02−30−001УЗ, 5, (Россия) с интенсивностью облучения 30 Вт/м2, расположенной на расстоянии 25 см от семян.

§ 3. Приготовление растворов.

Буферные растворы готовили путем смешивания отдельно приготовленных растворов 0.1М кислого и щелочного компонентов до необходимой величины рН. Для работы при рН 4,0 -5,5 использовали натрий-ацетатный, при рН 6,0 -8,0 натрий — фосфатный, а при рН 8,0−11,0 глицин — NaOH или TrisНС1 буферные растворы.

Раствор пероксидазы готовили путем растворения 1 мг фермента в натрий-фосфатном буфере, рН-7,0. Концентрацию фермента определяли спектрофото-метрически по поглощению при А=403нм 8 =100 мМ" 1 -см" 1 [124] и пиридингемохромогену [203]. Раствор о — дианизидина готовили по навеске в 96% этаноле. Раствор перекиси водорода готовили путем разбавления 30%-ного раствора в бидистиллированной воде. Концентрацию перекиси водорода определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции при А,=230нм s =72.7 М1см 1[204].

Для приготовления раствора аскорбиновой кислоты использовали бидистиллированную воду, концентрацию АК определяли, пользуясь коэффициентом экстинкции s = 7000М" 1-см" 1 при А, =265нм [205]- концентрацию аминазина определяли, пользуясь коэффициентом экстинкции 8=29 мМ" 1 см" 1 при Х=254 нм [206]. Раствор тиобарбитуровой кислоты готовили путем растворения навески 864 мг в 100 мл смеси 1% тритона Х-100 с 8,2 М этанолом. Остальные растворы готовили на бидистиллированной воде.

§ 4. Методика исследования.

4.1. Методика проведения физиологических исследований Влажность и всхожесть семян определяли используя методики Гостстандарта: всожесть — ГОСТ 12 038– — 66 — влажность — ГОСТ — 12 041 — 66.

4.1.1. Изучение влияния УФ-облучения на прорастание семян пшеницы Контрольные и опытные (после УФ-облучения) семена вначале замачивали в дистиллированной воде на 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 22° на свету, смачивая их дистиллированной водой (10 мл на чашку Петри). Для индукции перекисного окисления липидов семена с влажностью 5−6% в чашках Петри помещали под ртутнокварцевую лампу БНП02−30−001УЗ, 5, (Россия) с интенсивностью облучения 30 Вт/м, расположенной на расстоянии 25 см от семян. Всхожесть семян определяли на седьмые сутки прорастания. В каждой чашке было по 100 зерен, опыт проводился в 4-х повторностях.

4.1.2. Изучение влияния температуры на прорастание семян пшеницы Опытные образцы, замоченные в растворах антиоксидантов, помещали в камеру с температурой 5 °C на 24ч. Контролем служило сухое зерно и зерно, замоченное в дисстилированной воде при температуре 23 °C. Проращивание проводили при температуре 23 °C. Всхожесть семян определяли на седьмые сутки прорастания. В каждой чашке было по 100 зерен, опыт проводился в 4-х повторностях.

4.1.3. Изучение экзогенного влияния биологически активных веществ на вхожесть семян.

Семена замачивали в растворах БАВ в течение 24 ч, после этого их многократно промывали дистиллированной водой для удаления избытка БАВ. Проращивали семена на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 23С° на свету, смачивая их дистиллированной водой (10 мл на чашку Петри). Всхожесть семян определяли на седьмые сутки прорастания. Контролем служили семена замоченные в дистиллированной воде. Число семян в одной чашке Петри — 100, число повторностей в каждом варианте-4, число опытов-4.

Средние значения и их стандартные ошибки при проведении физиологических экспериментов определяли по методике [207], используя ППП Снедекор У2.

4.2. Методики проведения биохимических исследований 4.2.1. Методика определения активности пероксидазы Активность пероксидазы определяли при 22 °C по начальной скорости о-дианизидина перекисью водорода. К 2,2 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера рН 7,0 добавляли 0,1 мл раствора супернатанта и 0,1мл 0,43 мМ раствора о-дианизидина в 96%-ном этаноле. Реакцию инициировали введением 0,1мл 16 мМ перекиси водорода. После быстрого перемешивания реагентов, скорость реакции регистрировали на спектрофотометре по увеличению поглощения раствора продукта окисления о-дианизидина при Х=460 нм в =30 мМ^см" 1 [145]. За единицу активности фермента принимали количество о-дианизидина (мкмоль), окисленного за 1 мин 1 г сухой массы.

Каталитические параметры пероксидазы (Кт, Ут, ккат) определяли как описано в работе [208].

4.2.2. Методика определения перекисного окисления липидов с помощью тиобарбитуровой кислоты [6] Содержание малонового диальдегида исследовали по реакции с тиобарбитуровой кислотой при 1=532 нм (8=155мМ" 1см" 1) с нашими модификациями. К 0,5мл супернатанта последовательно добавляли 0,5мл 1%-ного раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М НС1 и 0,8 мл 0,06 М ТБК. Смесь нагревали на кипящей водяной бане Юмин. Охлаждение проводили при 15°- 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ трилона Б и 5−10 мл 96%-ного этанола. Контролем служила пробирка, в которую добавляли те же растворы, кроме ТБК. Содержание МДА в проростках выражали в нмоль/г сухой массы.

4.2.3. Методика определения содержания антиоксидантов [209].

К 0,2 мл супернатанта последовательно добавляли 0,2мл 0,5%-ного о-фенантролина в 96%-ном этаноле и 0,2 мл 0,2%-ного FeCb в 96%-ном этаноле. Затем объем доводили до 3 мл 96%-ным этанолом и выдерживали 10 мин в темноте. Измерение оптической плотности проводили при X — 505 нм, используя s = 2200 М^смЛ Определение антиоксидантов проводили по калибровочному графику, построенному для кверцетина. Количество антиоксидантов рассчитывали в мкг/г сухой массы.

4.2.4. Методика определения содержания аскорбиновой кислоты [209].

В опытную пробирку последовательно вносили 1мл фильтрата, 2,8 мл 0,1 М цитратного буфера рН 3,69, 0,05мл 0,03 М К3 [Fe (CN)6], 0,05мл 0,5 М NaF, 0,1 мл 0,074 М FeCl. Смесь выдерживали в течение 5 мин, после чего спектрофотометрировали при X — 700 нм. В качестве контроля использовали растворы, в которые добавляли 1 мл фильтрата и 4 мл 0,1 М цитратного буфера рН 3,69 и 1мл 50% этанола 3,8мл 0,1 М цитратного буфера рН 3,69, 0,05мл 0,03 М K3[Fe (CN)6], 0,05мл 0,5 М NaF, 0,1мл 0,074 М FeCl. Содержание аскорбиновой кислоты определяли по следующей формуле:

CV V PV.

Где С — концентрация аскорбиновой кислоты, определенная по калибровачному графику, мг/млVi — объем центрифугата ткани, млV2 -конечный объем пробы в кювете, млР — навеска ткани, гV — объем центрифугата взятого для определения, мл.

— 604.2.5. Методика определения активности алкогольдегидрогеназы [210] Семена гомогенизировали на механическом гомогенизаторе до получения однородной массы. Добавляли 0,05 М раствор глицина в соотношении 1:3. Для удаления не полностью разрушенных клеток и ядер гомогенат центрифугировали 10 мин при 7000 g. Активность фермента определяли в прямой реакции по скорости окисления этанола и образования NADH при Я = 340 нм с = 6,22мМ" 1см" 1. К 2,2мл ОДМ глицин — NaOH буфера рН 10 добавляли 0,1 мл 36 мМ раствора NAD и 0,1мл 0,41 М раствора этанола, перемешивали. Реакцию инициировали введением 0,1мл 2,5мкМ раствора АДГ. За единицу активности фермента принимали количество образованного NADH (мкмоль), при окислении этанола за 1 мин 1 г сухой массы.

4.2.6. Методика определения активности глюкозо-6- фосфатдегигидрогеназы.

211].

В типичном эксперименте в кювету вносили 2,2мл 0,01 М трис-HCl буфера рН 7,4, 0,1мл раствор MgCL2 с исходной концентрацией ОДМ, 0,1мл 0,025 М раствора NADP, 0,1мл 0,05 М раствора глюкоза-6-фосфата. Активность фермента определяли по скорости окисления глюкоза-6-фосфата и образования NADPH при 340 нм (s = 6,22 мМ^см" 1). За единицу активности фермента принимали количество образованного NADPH (мкмоль), восстановленного при окислении глюкоза-6-фосфата за 1 мин 1 г сухой массы.

4.2.7. Методика пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты Реакцию окисления АК (2,2−352,0 мкМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 23 °C в среде ОДМ натрий-ацетатного (рН 4,0−6,0) или натрий-фосфатного (рН 6,0−8,0) буфера, объемом 2.5 мл с участием пероксидазы хрена в концентрации 0,1−0,4 мкМ. Кинетические кривые окисления АК регистрировали по уменьшению поглощения на X = 265 нм (s = 7000 М^см" 1 [205]). За единицу активности фермента принимали количество мкмоль аскорбиновой кислоты, окисленной за 1мин. Кажущиеся константы скорости окисления аскорбиновой кислоты определяли из данных по стационарной кинетике [208].

4.2.8. Методика пероксидазного окисления гидрохинона Реакцию окисления гидрохинона (1−230 мкМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 23 °C в среде 0,1 М натрий-ацетатного, рН 4,0−6,0 или натрий-фосфатного, рН 6,0−8,0 буферов, в присутствии пероксидазы хрена. Окисление гидрохинона регистрировали по уменьшению поглощения при 290 нм (е = 2200 М" 1см" 1). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль гидрохинона за 1 мин. Кажущиеся константы скорости окисления гидрохинона определяли из данных по стационарной кинетике [208].

4.2.9. Методика пероксидазного окисления хлорпромазина [206].

Реакцию окисления хлорпромазина (7−112 мкМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 25° в среде 0,1 М натрий-ацетатного (рН 4,5−6,0) или натрий-фосфатного (рН 6,0−8,0) буфера объемом 2,5мл при концентрации пероксидазы хрена 50−100 нМ. Окисление аминазина регистрировали по уменьшению поглощения на А,=254 нм (е = 29 мМ^см" 1). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль субстрата хлорпропазина за 1 мин. Кажущиеся константы скорости окисления хлорпромазина определяли из данных по стационарной кинетике [208].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава I. Состояние антиоксидантной системы при прорастании семян пшеницы.

§ 1. Активность пероксидазы и содержание антиоксидантов при набухании семян пшеницы.

Наличие высокой активности пероксидазы в семенах и проростках пшеницы позволяет предположить об участии фермента в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы, активность которой определяет уровень устойчивости растений к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза [11]. Фермент способен катализировать окисление различных неорганических и органических соединений [10]. Обладая широкой субстратной специфичностью, фермент может проявлять свойства оксидазы [129]. Поэтому активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя.

Нами изучена динамика активности пероксидазы и содержание АО в семенах пшеницы в течение 24 часов набухания при 5 °C (I группа) и 23 °C (II группа). Видно, что процесс набухания семян сопровождается возрастанием активности фермента (рис. 1). Активность пероксидазы и содержание АО в зародыше у семян I группы было выше в 1,5 раза. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и кожуре в 1,5 и 1,8 раза соответственно (табл. 1).

Определены величины каталитических констант пероксидазы зерен пшеницы в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты (табл. 2). Показано, что Кт мало изменяется в исследованном диапазоне рН 5−7. Кт по о-дианизидину незначительно отличается от константы Михаэлиса, определенной для очищенного препарата пероксидазы хрена выпускаемой фирмой «КеапаГ, тогда как Кт по аскорбиновой кислоте в 5−9 раз ниже показателей очищенного препарата.

Такие различия можно объяснить за счет присутствия в гомогенате зерен посторонних субстратов пероксидазы, участвующих в совместном окислении аскорбиновой кислоты [9,10].