СИЛИКА-МЕТОД № 2, модифицированный под виноградную культуру кафедрой виноградарства КубГАУ

Растворы для выделения:

• * Экстракционный буфер: 2 мM Tris-HCl (pH 8,0); 20 мМ; 20 мМ EDTA (pH 8,0) и 5 М гуанидиний тиоционат. Довести до необходимого объема и проавтоклавировать [2, 37];
• * Раствор силики: смешать 1 часть частиц силики (Sigma S-5631) с 1 частью (к объему) стерилизованной воды (1 г-к-1 мл). Все приготовления проводить под вытяжкой. Тщательно перемещать и оставить на 12−24 ч. Затем вылить верхнюю жидкую фазу, нижний раствор с частицами силики заново разбавить с аналогичным количеством воды, которая была добавлена в начале процесса приготовления. Перемешать на вортексе и дать отстояться в течение 5−10 ч, вылить верхнюю жидкую фазу и удалить остаток воды путем испарения. Повторить процедуру с добавлением воды и ее удаления из частиц;
• * Промывочный буфер I (силика 1): 50 мМ CH₃COONa (pH 5,2); 20 мМ EDTA (pH 8); 5 M гуанидиний тиоционат или гидрохлорид; довести до 100% объема чистой водой и проавтоклавировать;
• * Промывочный буфер II (силика 2): 25% изопропанол; 25% этанол; 100 мМ NaCl; 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0); 2 мМ EDTA (pH 8,0); довести до 100% объема чистой водой и проавтоклавировать;
• * CH₃COONa (pH 5,2);
• * Изопропанол;
• * TE-буфер: 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 1 мМ EDTA (pH 8,0). Раствор проавтоклавировать.

Протокол выделения.

• 1) К размолотому в жидком азоте растительному материалу добавить 1000 мл экстракционного буфера.
• 2) Инкубировать при 37° C от 5 до 10 мин.
• 3) Отцентрифугировать при 12 000 оборотах 3 мин. при комнатной температуре.
• 4) Перенести верхнюю фазу в новую пробирку.
• 5) Добавить 4−5 мкл раствора с частицами силики и 25−30 мкл CH₃COONa перемешивать в течение 5 мин. по часовой стрелке.
• 6) Отцентрифугировать при 12 000 оборотах в течение 10 сек.
• 7) Удалить супернатант аккуратно.
• 8) Промыть раствором силики 1 путем добавления 500−700 мл.
• 9) Перемешать его на вортексе в течение 1 мин.
• 10) Отцентрифугировать при 12 000 оборотах в течение 10 сек.
• 11) Удалить супернатант аккуратно, не выливая белый осадок.
• 12) Повторить шаги 8, 9, 10 и 11.
• 13) Промыть раствором силики 2 путем добавления 1000 мл.
• 14) Перемешать его на вортексе в течение 1 мин.
• 15) Отцентрифугировать при 12 000 оборотах в течение 10 сек.
• 16) Удалить супернатант аккуратно, не выливая белый осадок.
• 17) Повторить шаги 13, 14, 15 и 16.
• 18) Промыть изопропанолом путем добавления 1000 мл.
• 19) Отцентрифугировать при 12 000 оборотах в течение 10 мин.
• 20) Высушить в течение 37° C 3 мин. и перевернуть пробирки для легкого высушивания.
• 21) Растворить белый осадок в 50 мкл TE.
• 22) Инкубировать 37° C в течение 15 мин.
• 23) Отцентрифугировать при максимальных оборотах в течение 1 мин. и перенести супернатант в новую пробирку.
• 24) Определить качество ДНК на спектрофотометре при длине волны A260.
• 25) Положить при -70° C на длительный период хранения и -20° C на короткий период хранения.