Материалы и методы

Виноградные образцы были собраны на территории Северного Кавказа. Тестировались два подвида: культурный виноград V. vinifera subsp. sativa D.C. и его дикий предок V. vinifera subsp. silvestris Gmel. (200 образцов).

Листья были собраны в разные сроки (молодые, взрослые и высушенные), однолетние и шестилетние (замороженные) и гербарные образцы. Для сравнения количества ДНК по разным методам использовали одно и то же количество для каждого образца — 1 г для свежего материала, для гербарных листьев количество пробы было уменьшено до 0,1−0,5 г [19].

СИЛИКА-МЕТОД № 1 [36].

Растворы для выделения:

• * Экстракционный буфер: 10 г CTAB (цетилтриметиламониум бромид); 140 мл 5 M NaCl; 25 мл 2 M Tris-HCl (pH 8); 20 мл 0.5 M EDTA (pH 8). Доводим до объема в 500 мл чистой водой и проавтоклавировать.
• * Раствор силики: смешать 1 часть частиц силики (Sigma S-5631) с 1 частью (к объему) стерилизованной воды (1 г-к-1 мл). Все приготовления проводить под вытяжкой. Тщательно перемешать и оставить на 12−24 ч. Затем вылить верхнюю жидкую фазу, нижний раствор с частицами оксида кремния «силики» повторно разбавить с аналогичным количеством воды, которая была добавлена в начале процесса приготовления. Перемещать на вортексе и дать отстояться в течение 5−10 ч, вылить верхнюю жидкую фазу и удалить остаток воды путем испарения. Повторить процедуру с добавлением воды и ее удаления из частиц;

Промывочный буфер: 25% изопропанол; 25% этанол; 100 мМ NaCl; 10 мМ Tris-HCl (pH 7.4); 2 мМ EDTA (pH 8); довести до 100% объема чистой водой и проавтоклавировать;

• * 5 M NaCl;
• * 70% этанол;
• * 5 M NaCl;
• * Изопропанол;
• * Рибонуклеаза A (Sigma R9009: 10 мг/мл).
• * TE-буфер: 10 мМ Tris-HCl и 1 мМ EDTA, pH 8.0 и проавтоклавировать.

Протокол выделения

• 1) Добавить 1200 мл экстракционного буфера (добавить 0,2% Я-меркаптоэтанола только перед использованием) и 2 мкл рибонуклеазы A к растительному материалу и перемешать на вортексе.
• 2) Инкубировать при 37° C от 5 мин. до 10 часов.
• 3) Добавить 500 мл хлороформа: спирт и перемешать тщательно 20−25 мин.
• 4) Отцентрифугировать при 6000 оборотах 15 мин. при комнатной температуре.
• 5) Перенести верхнюю фазу в новую пробирку.
• 6) Добавить 200−800 мкл раствора с частицами оксида кремния и перемешивать в течение 5 мин. по часовой стрелке.
• 7) Отцентрифугировать при максимальных оборотах в течение 1 мин.
• 8) Удалить супернатант аккуратно.
• 9) Промыть промывочным буфером путем добавления 1000 мл.
• 10) Отцентрифугировать при максимальных оборотах в течение 1 мин.
• 11) Удалить супернатант аккуратно.
• 12) Повторить шаги 9, 10 и 11.
• 13) Высушить в течение 37° C 3 мин. и перевернуть пробирки для легкого высушивания.
• 14) Растворить белый осадок в 400 мкл TE.
• 15) Инкубировать 68° C в течение 15 мин.
• 16) Отцентрифугировать при максимальных оборотах в течение 1 мин. и перенести супернатант в новую пробирку.
• 17) Промыть ДНК путем добавления 0.1 объема 5 M NaCl; затем добавить к общему объему 60% изопропанола.
• 18) Перемешать 1 мин., отцентрифугировать при максимальных оборотах в течение 1 мин., удалить супернатант.
• 19) Промыть осадок 70% этанолом.
• 20) Отцентрифугировать при максимальных оборотах в течение 1 мин. и вылить супернатант.
• 21) Определить качество ДНК на спектрофотометре при длине волны A260.
• 22) Положить при -70° C на длительный период хранения и -20° C на короткий период хранения.