Иммунологические аспекты патогенеза, дифференциальной диагностики и иммунотерапии язвенной разновидности базальноклеточного и метатипического рака кожи

Актуальность проблемы.

Проблема злокачественных эпителиальных новообразований является одной из актуальных в современной клинической дерматологии и онкологии. Накопленный в последние годы опыт в области диагностики и лечения опухолей кожи свидетельствует о возрастании частоты базаль-ноклеточного рака (БКР), составляющего по данным различных авторов (Б. А. Беренбейн, 1989; М. Н. Ежова, 1998; В. И. Кулагин с соавт., 2001; М. И. Курдина, 1991; Ю. В. Сергеев с соавт., 1999, 2000; С. L. Poo et al., 1990; L. N. Goldberg et al., 1996) 45−90% от всех злокачественных новообразований кожи.

Клиническая картина БКР весьма разнообразна и представлена различными по степени агрессивности формами (Я. Г. Грибанов, 1973; Сухова Т. Е., 2001; Т. П. Писклакова с соавт., 1998; Н. П. Малишевская, 1999; Е. С. Снарская, 1994; S. A. Collins, 1998; J. М. Nacyaert et al., 2001). Особое внимание специалистов привлекают язвенные варианты течения БКР, протекающие с выраженными деструктивными процессами и инфильтрацией тканей, часто рецидивирующие при различных методах лечения (Б. А. Беренбейн, 1983; М. Н. Ежова, Е. И. Третьякова, 1998; М. А. Ка-план с соавт., 1999; R. L. Моу et al., 1999). Они составляют по данным Суховой Т. Е. (2001) до 88%, и именно среди этих форм выявляют особый вариант опухоли — метатипический рак кожи (МТР) — характеризующийся наличием помимо базалоидного, плоскоклеточного пула клеток, происхождение которого обсуждается. ,(А. К. Апатенко, 1973; И. А. Казанцева, 2000; И. А. Цветкова, И. Н. Богатырева, 1993; О Braun-Falko, 2000; G. H Jakobs et al., 1982). Почти не отличаясь от язвенной БКР клинически, МТР очень редко диагностируется цитологически (Б. А. Беренбейн, 1989; Е. С. Снарская, 1994), не всегда своевременно определяется гистологически (И. А. Казанцева, И. Н. Богатырева, 1983; W. F. Lever, G. Shaumberg-Lever, 1983) и отличается более высокой степенью агрессивности. Его митотическая активность в 2 раза выше, чем БКР (И. А. Казанцева, И. И. Богатырева, 1982, 1983), а метастазирование МТР отмечается значительно чаще — в 8% случаев против 0,1% случаев при БКР (D. М. Borel, 1973; Е. R. Farmer et al., 1980). Можно предположить, что особенности течения язвенных БКР и МТР обусловлены как иммуногистохими-ческими особенностями клеток опухолевых комплексов, включая процессы апоптоза, стромы опухоли, так и состоянием противоопухолевого иммунитета макроорганизма. Иммунологические исследования при БКР малочисленны, носят разрозненный характер, включают обычно небольшое количество наблюдений, проводившихся суммарно при различных формах БКР и ограниченном спектре иммунологических параметров, от чего полученные данные часто противоречивы (А. А. Гармонов, 2002; Т. В. Карелина, И. А. Казанцева, 1991, 2000; Т. П. Писклакова, И. Г. Ильин, 1991; С. Campbell et al., 1993; I. G. Einspahr et al., 1999), а при МТР практически отсутствуют.

В отечественной литературе нет работ, отражающих состояние ци-токинового спектра крови при БКР, находящегося в тесной взаимосвязи с наследственным и адаптивным иммунитетом и жизнедеятельностью опухолевых клетокапоптоза лимфоцитов, субпопуляций дендритных клеток, адгезионных молекул, хемокинов, спектра интерлейкинов, оказывающих большое влияние на канцерогенез при БКР и МТР. Не проводилось изу4 чения природы МТР в эксперименте, так как не существовало его модели.

Несмотря на существование различных методов лечения БКР, все 1 они по существу носят разрушительный характер (криодеструкция, рент-гентерапия, хирургическое иссечение, фотодинамическая терапия) и не увязаны с патогенезом опухоли и чаще эффективны при поверхностных или микронодулярных не язвенных формах, при их небольших размерах. Далеко не всегда эффективны при язвенных БКР и МТР, чем и объясняется их частое рецидивирование. В то же время попытки использовать в том или ином виде иммунотерапию, в частности различные виды интер-феронов при БКР, оцениваются не однозначно так как не отработаны методики их использования при различных вариантах БКР (Б. А. Беренбейн f с соавт., 1985; А. А. Гармонов, 2002; В. А. Молочков с соавт., 1998; R. С. Cornell et al., 1990; Н. Т. Greenway et al., 1986; L. Wickramasinghe et al., 1989), а при МТР они не применялись вообще.

Цель исследования.

Разработка иммунологиеских аспектов патогенеза, дифференциальной диагностики и иммунотерапии рекомбинантными ИНФа2 язвенных БКР и МТР.

Задачи исследования.

1. Определить частоту язвенных БКР и МТР в структуре БКР на основе анализа панели 2050 случаев БКР.

2. Разработать экспериментальную модель МТР на животных.

3. Изучить состояние наследственного и адаптивного звеньев иммунитета и находящегося с ним в тесной взаимосвязи цитоки-нового спектра крови при язвенной БКР и МТР.

4. Изучить иммуногистохимические особенности язвенных БКР и МТР с использованием маркеров матриксных металлопротеиназ (ММР-1 и ММР-9), их эндогенных ингибиторов (Т1МР-1, Т1МР-2), Р53, РСКА.

5. Определить иммунологические и иммуногистохимические критерии дифференциальной диагностики язвенной БКР и МТР.

6. Разработать патогенетически обоснованный метод внутритканевой иммунотерапии язвенных БКР и МТР препаратами реком-бинантного интерферона а2.

Положения, выносимые на защиту.

1. В результате изучения 2050 случаев различных клинических форм БКР выявлено, что язвенная разновидность опухоли наиболее часто встречается (988 случаев, 64%) среди ее основной нодулярной (микро или макро) клинической формы, по отношению к которой частота метатипического рака кожи составляет 8,5%.

2. При клинико-морфологическом мониторинге развития МТР в эксперименте на коже крыс показано, что МТР образуется в результате метаплазии базалоидных клеток в атипичные шиповатые и является результатом прогрессии опухоли.

3. У больных язвенной БКР и МТР выявлен комплекс нарушений наследственного и адаптивного звеньев иммунитета, а также связанный с ним дисбаланс цитокинов в виде синдрома опухолезависимого вторичного иммунодефицита (СОВИД), степень выраженности которого при язвенных БКР коррелирует с тяжестью опухолевого процесса (стадия, степень изъязвления, активность течения), а при МТР характеризуется дисбалансом с превалированием активности адаптивного звена иммунитета с появлением аутоиммунных нарушений (СОВИДАН).

4. Опухолевые клеточные комплексы при язвенных БКР и МТР экспрессируют матриксные металлопротеиназы ММР-1, ММР-9, которые при МТР выявляются не только в цитоплазме опухолевых клеток, но и в строме опухоли за счет ослабления выработки Т1МР-1 и Т1МР-2 и инвазии клеток опухоли в окружающую ткань, что сопровождается более высоким индексом про-лиферативной активности — РСКА, и более выраженной экспрессией мутантного р53, по сравнению с БКР.

5. Внутритканевое введение препаратов рекомбинантного интерферона а2 (реаферона) в сочетании с вифероном (свечи, гель) при лечении язвенных БКР и МТР патогенетически обосновано и эффективно, может быть использовано как в виде самостоятельного метода, так и в составе комплексного лечения.

Научная новизна исследования.

1. Впервые на основе анализа обширного материала (2050 случаев различных форм базально-клеточного рака кожи) выявлена частота язвенных базалиом в общей структуре и показано, что основную массу из них составляют нодулярные (микро и макро) формы опухоли, которые изъязвляются в 64% случаев (988 из.

1560), в то время как на все остальные формы приходится лишь 1% язвенных разновидностей. При этом в 8,5% случаев среди язвенной разновидности опухоли встречается метатипический рак кожи (МТР).

2. Впервые получена экспериментальная модель МТР на коже крыс заявка № 2004 ИЗ 123 от 29.04.2004), и при клинико-морфоло-гическом мониторинге прослежено формирование МТР за счет метаплазии базалоидных клеток в атипичные шиповатые, как результат прогрессии опухоли.

3. Впервые проанализировано состояние иммунной системы в сочетании с цитокиновым спектром крови по 136 параметрам при язвенной БКР и МТР и получены достоверные данные об изменениях наследственного и адаптивного звеньев иммунитета, включая фагоцитарную функцию, цитотоксичность, комплемент, дендритные клетки крови, Ти В-звенья иммунитета, апоптоз лимфоцитов на основании чего выявлены 2 иммунофе-нотипа: СОВИД — синдром опухолезависимого вторичного иммунодефицита при БКР, степень проявления которого коррелирует с тяжестью клинической картины (размера опухоли, степени изъязвления, активности течения) и СОВИДАН — синдром опухолезависимого вторичного иммунодефицита с аутоиммунными нарушниями при МТР, что вносит вклад в представления об иммунопатогенезе БКР и МТР и может быть использовано для ранней иммунодиагностики МТР.

4. Впервые проанализирован цитокиновый спектр крови у больных БКР и МТР, включающий 14 видов интерлейкинов, интер-фероны альфа и гамма, ПЧР-а, ТОР-Ь2, УЕОБ, адгезионные молекулы 8УСАМ-1, Ь и Е-селектины, Е и N кадхерины, хемокины в совокупности с активностью ТЪ-1 и ТЪ-2 ответа и выявлен комплекс изменений, наблюдающийся при МТР и БКР, что может быть использовано как для представлений об иммунопа-тогенезе этих опухолей, так и для ранней диагностики МТР.

5. Впервые изучены особенности экспрессии матриксных металло-протеиназ (ММР-1, ММР-9) и их эндогенных ингибиторов (Т1МР-1, Т1МР-2) в опухолевых комплексах БКР и МТР, и выявлена интенсивная экспрессия матриксных металлопротеиназ, особенно при МТР, где она выявляется не только в цитоплазме клеток опухолевых комплексов, но и в окружающей строме за счет диссеминированной инвазии опухолевых клеток на фоне дефицита эндогенных ингибиторов металлопротеиназ, сообщая опухоли большую агрессивность в сочетании с более высоким содержанием РСКА и мутантного Р-53 по сравнению с БКР.

6. Разработан способ лечения БКР и МТР (патент № 2 229 306/ 2002 131 720 от 27.05.2004. бюл № 15) внутритканевым введением препаратов рекомбинантного интерферона альфа2 (реафе-рон) в сочетании с вифероном (свечи и гель).

Практическая значимость.

Разработан метод получения экспериментального МТР на крысах, позволяющий продолжить изучение этого вида опухоли и средств ее терапии на экспериментальных животных (№ 2004 113 123 от 29.04.2004).

Разработаны представления об особенностях иммунопатогенеза язвенных БКР и МТР, позволяющие использовать выявленные изменения ряда иммунологических параметров для ранней диагностики МТР и дифференциальной диагностики его с язвенной разновидностью БКР, а также для оценки степени агрессивности процесса и эффективности терапии.

Впервые разработан метод внутритканевой терапии БКР и МТР препаратами рекомбинантного интерферона а2 (реаферона в сочетании с вифероном) (патент на изобретение № 2 229 306), который может быть использован как самостоятельный метод или в составе комплексной терапии язвенных БКР и МТР.

Внедрение работы.

Результаты работы внедрены в практику отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ, Московского областного кожно-венерологического диспансера, на курсе дерматовенерологии ФУВ МОНИКИ, на кафедре кожных и венерических болезней ФППО ММ, А им. И. М. Сеченова. Опубликованы: методические указания МЗРФ «Организационная технология взаимодействия кожно-венерологической и онкологической служб по оказанию специализированной помощи больным предопухолевой и злокачественной патологией кожи». Москва, 2004 г.- пособие для врачей «Базалиома» М., 2002 г.- монография «Базалиома» М., 2003 г., глава в книге «Экциклопедия клинической онкологии» М., 2004, получен патент на изобретение РФ «Способ лечения базалиом» № 2 229 306/2002 131 720 от 27.05.2004 бюл № 15) и приоритетная справка на изобретение № 2004 113 123 от 29.04.2004 «Способ моделирования базалиом на экспериментальных животных» .

Апробация работы.

Диссертация апробирована на совместной научной конференции отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского, курса дерматовенерологии ФУВ МОНИКИ.

Материалы диссертации доложены на IV ежегодной Российской Онкологической конференции РОНЦ им Блохина (ноябрь 2002, Москва), научно-практической конференции «Новые лекарственные препараты в практике дерматовенеролога» (Москва, 2002), Всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии (Сингапур, декабрь 2002), 2 Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, май 2004), заседании Московского общества дерматовенерологов (Москва, январь 2005).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ (в отечественной и зарубежной печати), в том числе 1 монография, глава в «Энциклопедии клинической онкологии» .

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 233 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 26 таблицами, 9 графиками, 91 рисунком.

выводы.

1. Впервые разработана экспериментальная модель МТР. В результате аппликаций 0,1% р-ра канцерогена ДМБА фракционно на кожу крыс, язвенная разновидность БКР развивалась из предшествующей ей нодулярной формы этой опухоли на 10—11 месяце эксперимента, а метатипический рак развивался из язвен-но-нодулярной формы на 11—12 месяце эксперимента.

2. На основании анализа 2050 случаев БКР установлено, что частота наиболее упорно протекающей язвенной разновидности нодулярных базалиом составила 64%, язвенные разновидности других форм БКР — составили 1% случаев, а доля метатипиче-ского рака в структуре язвенной разновидности БКР — 8,5%.

3. Иммунологические изменения при язвенных БКР включали: снижение содержания в крови субпопуляций ДК, тенденцию к супрессии эффекторных звеньев иммунитета (фагоцитоза, цито-токсичности, 1ЧК-клеток, В-лимфоцитов) с усилением апоптоза Т-лимфоцитов, особенно выраженных при БКР в стадиях Т2— Т3]ЧоМо II—III степени изъязвления, в то время как при МТР характерно увеличение содержания субпопуляций фагоцитарных клеток, 1ЧК-клеток и В-лимфоцитов с развитием аутоиммунных нарушений (АТ, ЦИК, С5, С5а).

4. Дисбаланс спектра цитокинов крови при БКР проявлялся подавлением секреции ИЛ-12 и ИНФ-гамма находящихся в связи с уменьшением доли ТЬ-1 клеток и уменьшением индекса ТЬ-1/ ТЬ-2- снижением продукции ИЛ-1р, связанным с уменьшением субпопуляций ДК-клеток, что в свою очередь обуславливало гипофункцию В-системы, снижением уровня ИЛ-21, ИЛ-7, ИЛ-9, что способствовало ослаблению фагоцитоза, цитотоксичности и дифференцировки клеток на фоне совокупного дефицита ИНФ-альфа и гамма, увеличением ИЛ-10 (в 2 раза), ИЛ-6, ИЛ-8 способствующих митогенному и ангиогенному эффектам и подавлению апоптоза опухолевых клеток. При МТР характерна стимуляция Т11−2 ответа с понижением Тк-1/ТЬ-2 на фоне резкого повышения уровней ИЛ-5 (в 2 раза), ИЛ-10 (в 4 раза), увеличения ИЛ-1(3 и ДК в совокупности способствующих гиперактивности В-звена с появлением признаков аутоиммунных наруше-ни: увеличение ИЛ-6 (в 6 раз), ИЛ-8 (в 3 раза) и ИЛ-10, значительно превосходящее таковое при БКР, оказывало выраженный митогенный и ангиогенный эффекты, а снижение ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-13 (в 4 раза) усиливали агрессивность опухоли, создавая условия для смены иммунофенотипа, а недостаточность адгезионного пула (адгезинов, селектинов, Е-кадхерина) способствовала нестабильности стромы опухоли облегчая ее инва-зивность.

Выявленные изменения иммунитета и цитокинового спектра у больных язвенными БКР и МТР являются важными звеньями патогенеза опухоли и могут быть использованы для ранней иммунодиагностики, дифференциальной диагностики с МТР, оценки течения заболевания и эффективности терапии. Разработан клинико-лабораторный метод дифференциальной диагностики МТР и язвенной разновидности БКР, основанный на применении иммуногистохимических маркеров: матриксных металлопротеиназ (ММР1 и ММР9), и их тканевых ингибиторов (Т1МР-1, 2), маркера пролиферативной активности — РС-КА и супрессора малигнизации Р53, характер экспрессии которых при МТР отличается большей выраженностью и зоной рас пространения на фоне дефицита Т1МР, свидетельствуя о более высокой степени пролиферативной активности и инвазивности МТР на фоне значительной потери функции контроля апоптоза.

7. Разработанный метод внутритканевой терапии язвенной разновидности БКР и МТР рекомбинантными препаратами интерферона альфа 2 (реаферона) в сочетании с вифероном (свечи, гель) патогенетически обоснован и может быть использован в виде самостоятельного метода лечения язвенной БКР, главным образом в стадии Т^оМо I—II степени изъязвления или в составе комплексной терапии больных БКР и МТР в стадиях Т2— Т3]ЧоМо II—III степени изъязвления.

Характеристика использованных препаратов:

Реаферон (регистрационный номер РМЮ6 642 101, лицензия 42/ 240/2002/ свид. № 179 487) — рекомбинантный интерферон альфа 2, выпускаемый в виде лиофилизированного порошка для приготовления раствора для инъкций. Производство Россия.

Виферон (регистрационный номер 96/432/5, 19.06.97) — комплексный препарат, выпускаемый в свечах и в виде геля, в состав которого входит человеческий рекомбинантный интерферон альфа 2, антиоксидант-ный препарат (альфа-токоферола ацетат и основа (масло какао). Производство Россия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проблема злокачественных эпителиальных новообразований кожи является одной из актуальных в современной клинической дерматологии и онкологии. Накопленный в последние годы опыт в области диагностики и лечения опухолей кожи свидетельствует о возрастании частоты ба-зальноклеточного рака (БКР), составляющего по данным различных авторов (Б. А. Беренбейн, 1989, M. Н. Ежова, 1998, В. И. Кулагин с соавт., 2001, М. И. Курдина, 1991, Ю. В. Сергеев с соавт., 1999, Ю. В. Сергеев с соавт., 2000, С. L. Foo et al., 1990, L. N. Goldberg et al., 1996) 45—90% от всех злокачественных новообразований кожи. Клиническая картина БКР весьма разнообразна и представлена различными по степени агрессивности формами (Я. Г. Грибанов, 1973, Сухова Т. Е., 2001, Т. П. Писклакова с соавт., 1998, Н. П. Малишевская, 1999, Е. С. Снарская, 1994, S. A. Collins, 1998, J. D. Fleming et al., 1995, С. J. McCormack et al., 1997, J. M. Na-cyaert et al., 2001). Особое внимание специалистов привлекают язвенные разновидности БКР, протекающие с выраженными деструктивными процессами и инфильтрацией тканей, часто рецидивирующие при различных методах лечения (Б. А. Беренбейн с соавт., 1983, M. Н. Ежова, Е. И. Третьякова, 1998, Н. Г. Дайнова, 1998, М. А. Каплан с соавт., 1999, R. С. СогпеИ et al., 1990, A. S. Мак et al., 1995, R. L. Moy et al., 1999). Они составляют по данным Суховой Т. Е. (2001) до 88% среди рецидивирующих форм БКР. К тому же именно среди этих форм выявляют особый вариант опухоли — метатипический рак кожы (МТР), характеризующийся помимо базалоидного плоскоклеточным пулом клеток, происхождение которого обсуждается (А. К. Апатенко, 1973, И. И. Богатырева, 1984, И. А. Казанцева с соавт., 1983, Т. В. Карелина, И. А. Казанцева, 1991, G. Н. Jacobs et al., 1982, О. Braun-Falco, 2000). Почти не отличаясь от язвенной БКР клинически, МТР очень редко выявляется цитологически (Б. А. Беренбейн, 1989, Е. С. Снарская, 1994), не всегда своевременно диагностируется гистологически (И. И. Богатырева, 1984, И. А. Казанцева, И. Н. Богатырева, 1983, С. Г. Приходько с соавт., 1986, W. F. Lever, G. Shaumberg-Lever, 1983) и отличается более высокой степенью агрессивности. Его митотиче-ская активность в 2 раза выше, чем БКР (И. А. Казанцева, И. И. Богатырева, 1982, 1983), а метастазирование МТР отмечается значительно чаще — в 8% случаев против 0,1% случаев — при БКР (D. M. Borel, 1973, Е. R. Farmer, S. В. Helwig, 1980). Можно предположить, что особенности течения язвенных БКР и МТР обусловлены как иммуногистохимическими особенностями клеток опухолевых комплексов, включая процессы апоп-тоза, стромы опухоли, так и состоянием противоопухолевого иммунитета макроорганизма. Иммунологические исследования при БКР малочисленны, носят разрозненный характер, включают обычно небольшое количество наблюдений, проводившихся суммарно при различных формах БКР и ограниченном спектре иммунологических параметров, от чего полученные данные часто противоречивы (А. А. Гармонов, 2002, Т. В. Карелина, И. А. Казанцева, 1991, 2000, Т. П. Писклакова, И. Г. Ильин, 1991, Т. П. Писклакова, 1991, С. Campbell et al., 1993, L. Cerroni, H. Kerl, 1994, A. L. Dellon et al., 1977, M. Dohlsten et al., 1988, I. G. Einspahr et al., 1999, D. A. Wong et al., 2000), a при МТР практически отсутствуют.

В отечественной литературе нет работ, отражающих состояние ци-токинового спектра крови при БКР, находящегося в тесной взаимосвязи с наследственным и адаптивным звеньями иммунитета и жизнедеятельностью опухолевых клеток, апоптоза лимфоцитов, субпопуляций дендритных клеток, адгезионных молекул, хемокинов, спектра интерлейкинов, оказывающих большое влияние на канцерогенез при БКР и МТР. Не проводилось изучения природы МТР в эксперименте, так как не существовало модели его получения.

Несмотря на существование различных методов лечения БКР все они по существу носят разрушительный характер (криодеструкция, рентгенотерапия, хирургическое иссечение, фотодинамическая терапия) и не увязаны с патогенезом опухоли. Они чаще эффективны при поверхностных или микронодулярных неязвенных формах БКР, небольших размерах опухоли и далеко не всегда эффективны при язвенных БКР и МТР, чем и объясняется их рецидивирующее течение. В то же время попытки использовать в том или ином виде иммунотерапию, в частности различные виды интерферона при БКР, оцениваются не однозначно, т. к. не отработаны методики их использования при различных вариантах БКР (Беренбейн Б. А. с соавт., 1985, А. А. Гармонов, 2002, В. В. Малиновская, 1996, В. А. Молочков, А. Н. Хлебникова, 1996, В. А. Молочков с соавт., 1998, R. С. Cornell et al., 1990, Н. Т. Greenway et al., 1986, L. Wickramasinghe et al., 1989).

Целью нашего исследования явилось изучение ряда аспектов имму-нопатогенеза, дифференциальной диагностики и иммунотерапии реком-бинантным ИФНа2 язвенных БКР и МТР. Задачи исследования: оценить частоту язвенных БКР и МТР в структуре БКР на основе анализа 2050 случаев БКРизучить особенности формирования МТР на коже крыс в экспериментеизучить особенности опухолевых комплексов при БКР и МТР с помощью иммуногистохимических методов, выявляющих экспрессию матриксных металлопротеиназ (ММР-1, ММР-9) и их эндогенных ингибиторов (TIMP-1, TIMP-2), Р53, PCNA, отражающих степень агрессивности опухоли, и влияния на окружающие ткани и процессы иммунитетаизучить состояние наследственного и адаптивного звеньев иммунитета у больных язвеннойБКР и МТР, включающих следующие параметры: состояние фагоцитарной функции rip содержанию субпопуляций экс-прессирующих маркеры макрофагов и нейтрофилов, адгезионной, поглотительной и переваривающей способности фагоцитовестественной и ци-токинозависимой цитотоксичности (LAK-клетки, ЦИ, NK-клетки и их субпопуляции) — системы комплементасубпопуляции дендритных клеток кровиВ.-звена иммунитета по содержанию субпопуляций В-лимфоцитов, концентрации иммуноглобулинов, ЦИК, аутоАТТ-звена иммунитета по содержанию субпопуляций Т-лимфоцитов, ИРИ, пролиферативной активности Т-лимфрцитовапоптоз лимфоцитов. Изучить состояние цито-кинового спектра?, крови включающего содержание интерлейкинов, интер-феронов, адгезионных молекул, факторов VEGF, TGF-|32, TNF-a, хемокинов, субпопуляций ТЫ и Th2 клеток, вырабатываемых цитокиныразработать иммунологические и иммуногистохимические признаки для ранней диагностики МТР, разработать и патогенетически обосновать метод внутритканевой терапии ¦ язвенных БКР и МТР препаратами рекомби-нантного интерферона а2.

Работа проводилась на архивном, материале (1990—1998 г.) и исследования опухолей у больных, находящихся на лечении в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологйи Московского областного научно-исследовательского института за период 1999—2003 гг., что в совокупности составило 2050 случаев БКР, из которых у .988 больных диагностирован язвеннонодулярный БКР и у 91 больного МТР. Помимо общепринятых методов исследования: физикальных, инструментальных, лабораторных, цитологического и гистологического исследований у 20 больных (10 случаев язвенного БКР и 10 — МТР стадии T2N0Mo II степени изъязвления) проведены имMyiюгистохимические исследования опухолей на базе отделения патанатомии Московского научно-исследовательского онкологиче V — ' 188 -. ,'¦.¦¦.¦: ' - ского института им. П. А. Герцена, включающие определение матриксных металлопротеиназ и их эндогенных ингибиторов, супрессора малигниза-ции Р53, пролиферирующего ядерного антигена РСКА. Иммунологические исследования проводились в лаборатории иммунологии МОНИКИ, для чего исследовалась кровь 44 больных (32 больных БКР и у 12 — МТР) и 40 здоровых доноров (группа контроля). При этом у каждого больного проанализировано 136 параметров, отражающих активность наследственного и адаптивного звеньев иммунитета и цитокиновый спектр крови. Интерфероновый статус проанализирован в динамике (до и после лечения) у 51 больного БКР и МТР, получавших интерферонотерапию.

Экспериментальные исследования проведены в виварии Российского научного центра РАМН им. Н. Н. Блохина на 50 крысах, в процессе которого разработан метод получения МТР и проведен мониторинг кли-нико-морфологических изменений кожи, включающий 40 биопсий кожи.

Лечение разработанным нами методом внутритканевого введения препаратов рекомбинантного интерферона а2 в сочетании с вифероном получили 51 больной БКР и МТР.

Методы исследования.

Для выявления экспрессии в опухолевых комплексах ММР и TIMP использованы парафиновые срезы кожи, инкубированные с моноклональ-ными антителами (Novocastra) к ММР-1 1:10, ММР-9 1:40, TIMP-1 1:10, TIMP-2 1:25. Для визуализации использована система детекции Envision (ДАКО). Хромоген — диаминобензидин. Среды обработаны в специализированном миниавтоклаве t 121 °C в течение 20' и охлаждены в течение 2 часов. Время инкубации с антителами — 60'. Срезы докрашивались гематоксилином. Для выявления экспрессии Р53, PCNA и цитокератинов использовались антитела ДАКО-Р53, ДО-7 1:100, и пероксидазная методика с визуализацией иммунного окрашивания стрептавидбиотинавидиновым методом с использованием набора ISAB (ДАКО).

Исследование субпопуляционного состава клеток CD1+, CDld+, CD3+, CD3+HLA-DR+, CD4+CD25+, CD4+HLA-DR+, CD5+, CD7+, CD8+, CD8+CD25+, CD8HLA-DR+, CD116+, CDllc+, CD14+, CD16+, CD19+, CD20+, CD21+, CD22+, CD23+, CD25+, CD28+, CD38+, CD45+, CD56+, CD80+, CD86+, CD95+, CD158a+, CD158b+, CD163+ периферической крови проводили путем иммунофенотипирования клеток на приборе FACS-Calibur (Beeton Dickinson, США) с применением соответствующих моно-клональных антител. CD69+ определяли с помощью набора Fas-Immune (Beeton Dickinson, США). Использовались также значения индексов супрессии, помощи, апоптоза. Иммуноглобулины IgG, IgM и IgA изучали с помощью метода радиальной иммунодиффузии по Манчини. Количественное определение ЦИК в сыворотке крови проводили методом ПЭГ-преципитации с использованием 2-х концентраций (3,5% и 4%) ПЭГ-6000. Концентрация аутоантител: антиСо1, В7-Н1, ANA, ANSA, АКА определялась методом ИФА. Фагоцитарная активность оценивалась по содержанию соответствующих субпопуляций, по адгезивной способности нейтрофилов в реакции люминолзависимой хемилюминесценции и тестов на поглотительную и переваривающую способности нейтрофилов.

Исследование активности NK-клеток проводилось в стандартном Н3-уридиновом цитотоксическом тесте против клеток-мишеней линии К562.

Оценка цитокинового статуса проводилась по определению концентрации в периферической крови IL-lp, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18 и IL-21, интерферонов, а и у с по- 190 мощью НФА наборов НПО «Протеиновый контур» г: Санкт-Петербург, «Research Diagnostic System» Англия,' «Promega» США, «Biomar Diagnostic Systems» Германия.

Исследование. TNF-a,. 'TGjF-^.' адгезионных молекул ICAM-1, VCAM-1, L и Р-селектинов, Е й N-кадхеринов, хемокинов CCL2, RANTES проводилось с помощью И ФА при использовании ИФА-набо-ров НПО «Протеиновый контур» г. Санкт-Петербург, «Ignogenetics» Бельгия, «ResearchDiagnostic System» Англия^" Promega" США и др.

Исследование содержания и активности ТЫ и Th2 клеток проводилось путем оценки продукции внутриклеточных цитокинов (IL-2 и уИФН в случае Thl клеток и IL-4 — в случае Th2 клеток) с CD4+ лимфоцитах с использованием проточной цитометрии.

Статистическую^ обработку результатов проводили с использованием критерия Стыодента t.

За период с 1990 по 2003 гг. в отделении дерматовенерологии и дер-матоонкологии МОНИКИ наблюдались 2050 больных с различными формами БКР в возрасте от 30 до 71 года и старше, 74% которых были в возрасте от 51 года до 70 лет, из них 1209 женщин и 841 мужчина. Среди основной группы больных с нбдулярной формой БКР (1560 человек или 76%) у 988 больных (64%) отмечалась ее язвенная разновидность, которая при других формах БКР встречалась лишь, в 1% случаев. У 91 больного выявлен особый вариант опухоли — МТР, составивший 4,5% случаев. от всех случаев: БКР. и 8,5% от ее язвенной разновидности. В: 60% случаев МТР был диагностирован на этапе очередного рецидива БКР чаще солидного, солидноаденоидного или других смешанных гистологических типов.

ОПУХОЛИ. ' • - • '.

988 случаев язвеннонодулярных БКР и 91 случай МТР проанализирован по 16 клиническим параметрам, разработанным нами ранее • '.'¦ ¦ '.' -191 — -л • '" .••:: ¦

1994 г.). Средний возраст больных язвенными БКР составил 55,3 ± 1,2, МТР — 62,9 ± 2, средняя давность онкологического анамнеза при язвенной БКР 5,1 ± 0,5 лет и при МТР — 7,7 ±1,7 лет. При наличии рецидивирующего характера течения процесса у 57% больных язвенными БКР на протяжении нескольких лет мы не наблюдали случаев их метастазирова-ния, в то время как при МТР из 91 случая в одном (1%) были выявлены метастазы в лимфатических узлах и коже. Преимущественная локализация язвенных БКР и МТР почти полностью совпадала: кожа носа, щек, переорбитальной зоны, висков, лба, области носогубного треугольника, околоушной зоны, подбородка. Рецидивирующее течение язвенных БКР предшествовало диагностике МТР в 60% случаях, особенно при давности процесса более 5 лет. Для МТР были характерны более значительные размеры опухоли, чем при язвенных БКР (1,5 ± 0,7 см и 2,5 ± 0,8 см соответственно), 66% БКР были в стадии Т^оМо при размере опухоли до 1 см, а при МТР 41,7% опухолей хотя и соответствовали стадии Т^оМо, но размеры опухоли варьировали от 1 до 2 см, в 38,4% случаев МТР величина опухоли была в пределах 2—5 см (Т21Ч0М0), а в остальных 19,9% случаев превышала их. При этом язвенные БКР в основной своей массе (804 случая или 81,3%) имели язвенный дефект I степени, при МТР I степень изъязвления наблюдалась лишь у 16,6% больных, в то время, как у 64,8% больных МТР наблюдалась II степень и в 18,6% — III степень изъязвления. Таким образом клинические проявления язвенных БКР и МТР имеют гораздо больше общего, чем различий и позволяют в ряде случаев лишь предположить диагноз МТР.

Для изучения формирования патологического процесса при МТР мы разработали метод получения МТР в эксперименте на коже крыс (заявка на изобретение № 2004 113 123 от 29.04.04 г.) совместно с сотрудниками Российского онкологического научного центра РАМН. В качестве канцерогена был использован 0,1% раствор ДМБА по определенной методике и на протяжении 12 месяцев осуществлялся клинический и гистологический мониторинг изменений кожи у 50 крыс, использованных в эксперименте.

Всего в течение эксперимента произведено 40 биопсий на 11—12 месяцах наблюдения МТР удалось получить у 30% крыс и показать, что он формируется в результате зарождения плоскоклеточного пула в центральной части опухоли путем метаплазии базалоидных клеток в атипичные шиповатые. При этом по краю опухоли сохраняется базалоидный пул клеток, не содержащий нормального эпителия или признаков псевдоэпи-теллиоматозной гиперплазии, что исключило предположение о том, что МТР является опухолью-столкновением и подтвердило гипотезу формирования МТР за счет метаплазии базалиоидных клеток как следующего этапа прогрессии опухоли.

Для исследования матриксных металлопротеиназ ММР-1 и ММР-9, их эндогенных ингибиторов Т1МР-1 и Т1МР-2, пролиферативного ядерного антигена РСМА, супрессора малигнизации Р53, использован био-псийный материал 20 опухолей кожи больных (10 случаев МТР и 10 — яз-веннонодулярных БКР в стадии Т21Ч0М0 III степени изъязвления). Выявлено, что опухолевые клетки язвенной БКР и МТР активно продуцируют матриксные металлопротеиназы ММР-1 и ММР-9, что проявляется их интенсивной экспрессией (диффузное коричневое окрашивание) в цитоплазме клеток опухолевых комплексов при БКР. Во всех опухолях МТР отмечена интенсивная экспрессия ММР-1 и ММР-9 не только в клетках опухолевых комплексов, но и за их пределами в строме опухоли в виде мелких рассеянных участков, что свидетельствует о проникновении клеток опухоли (реакция на цитокератин в них положительная) в окружающий стромальный каркас. Не исключено, что этому способствует дисбаланс с эндогенными ингибиторами металлопротеиназ TIMP-1 и TIMP-2, выявленный при МТР, где экспрессия TIMP-1 в клетках опухоли выражена слабо, a TIMP-2 практически не выявляется. Таким образом эффекты металлопротеиназ при МТР выраженысильнее, что проявляется отмеченной выше инвазией: опухолевых клеток в окружающую ткань, усилением процессов пролиферации: PCNA выявлен в 28,0 ± 4,1% клеток при БКР, в то время как МТР он выявлен в 87,5 +.2,5% опухолевых клеток (р < 0,01), мутантный Р53 лишенный свойств супрессора малигнизации был выявлен в 62,7 ± 11,0% опухолевых клеток МТР, в то время как в опухолях БКР он выявлялся лишь в 24,4 ± 4,5% клеток (р < 0,05). Таким: образом, большая пролиферативная активность и инвазивность опухоли при МТР происходит на фоне значительной потери функций контроля апоп-тоза опухолевых клеток, что обеспечивает приобретение опухолью arpee.-, сивных свойств и устойчивости к терапии. Кроме того известно, что ММР-9 снижает интенсивность IL-2 зависимой пролиферации Т-лимфоцитов, способствуя тем самым развитию иммуносупрессйи.

Комплексное иммунологическое исследование, включающее 136 параметров,. отражающих состояние наследственного и адаптивногозвеньев иммунитета и цитокиновый спектр крови, проведено у 44 больных, у 34 — из которых диагностирован язвенный БКР, у 10 — МТР. Больные БКР были разделены на 2 группы в зависимости от течения и стадии процесса, размеров и степени изъязвления опухоли. В 1 группу (п = 15) включены больные с безрецидивным течением БКР в стадии TjNqMq 1—11 степени изъязвления, 2. группу (п — 19) составили больные с рецидивирующим течением БКР в стадиях T2N0M0—T3N0M0 11—111 степени изъязвления, 3 группу, (п = 10) составили больные МТР в стадиях T2N0M0— T3N0M0 11—111 степени изъязвления. Все опухоли верифицированы гистологически при изучении серийных срезов биоптата.

Состояние наследственного звена иммунитета оценивалось по показателям, отражающим состояние фагоцитарной функции, естественной (ЕЦТ) и цитокинозависимой цитотоксичности, активности системы комплемента и дендритных клеток (ДК) крови.

Фагоцитарная функция: у всех больных БКР (в 1-й и 2-й группе) выявлено уменьшение содержания (%) части субпопуляций экспресси-рующих маркеры макрофагов (СВ11Ь+ — 11,2 ± 3,1 и 7,1 ± 2,0 соответственно при норме 22,2 ± 9,4, С014+ — 12,9 ± 4,0 и 9,1 ± 5,2 при норме 18,7 ± 7,7, СБ64+ — 1,8 ± 1,0 и 1,1 ± 0,4 при норме 2,1 ± 0,4, р < 0,05), подавление агрезионной (% адгезии 25,4 ±1,6 и 13,4 ±8,2 при норме 29,5 ± 2,7, р < 0,05), поглотительной и переваривающей способности фагоцитов крови (латекс-тест: % фагоцитировавших клеток 45 ± 8 и 34 ± 19 при норме 60 ± 20, фагоцитарный индекс — 6,1—8,3 и 3,8—7,4 при норме 8,5—12,2- НСТ-тест (спонт.) % — 8,9 ± 4,4 и 4,2 ± 1,3 при норме 9,5 ± 3,1- РЛЗХЛ (индуцир.) имп/сек: 2990 ± 559 и 1228 ± 669 при норме 3112 ± 448, р < 0,05).

У больных МТР (3-я группа) хотя и сохраняется сниженное по сравнению с нормой содержание клеток с фенотипом СВ14+ (13,8 ± 5,2), однако по сравнению с БКР выражена тенденция к их увеличению, содержание субпопуляций СОПЬ+ и СБ64+ (15,0 ± 2,1 и 5,2 ± 2,9 соответственно) в пределах нормы или несколько повышено (р < 0,05). При этом почти все виды функциональной активности фагоцитов в пределах нормы (латекс-тест: % фагоцитировавших клеток 62 ± 16- фагоцитарный индекс 8,2—9,0- НСТ-тест (спонт.) % — 6,9 ± 4,3- РЛЗХЛ (индуциров.) имп/сек 3338 ± 621- адгезия % - 25,1 ± 15,6).

Естественная и цитокинозависимая цитотоксичность.

У больных БКР выявлена тенденция к угнетению функции лимфо-кин-активированных ЬАК-клеток в ответ на стимуляцию 1Ь-2 (44—60% во 2-й группе при норме 60—75%) — снижение цитотоксического индекса (ЦИ) до 44—68% и 33—65% в 1-й и 2-й группах соответственно при норме 50—70% и удельной активности ШС-клеток до 6,2—11,4 и 3,5—10,2 при норме 7—12 усл. ед. с уменьшением доли субпопуляций несущих маркеры Ж-клеток: СБ16+ до 18,4 ± 6,9 и 14,9 ± 4,2 при норме 20,8 ± 4,9, СБ56+ до 16,5 ± 4,2 и 11,2 ± 4,9 при норме 18,8 ± 5,6, СВ57+СБ8+ до 8,3 ± 3,4 во 2-й группе при норме 12,2 ± 4,1, СБ158а+ до 7,9 ± 3,1 и 5,4 ± 2,6 при норме 8,9 ±2,1, СБ158Ь+ до 4,2 ± 1,3 во 2-й группе при норме 7,0 ± 1,9 и СВ161+ до 2,2 ± 1,8 во 2-й группе при норме 4,4 ± 1,3, достоверно усиливающуюся во 2-й группе больных БКР (р < 0,05).

У больных МТР (3-я группа) отмечена в отличие от больных БКР нормальная активность ЬАК-клеток (77—118%) и большинства показателей ЕЦТ: ЦИ (52—73%), удельная активность ТЧК-клеток (7,2—12,1 усл. ед.), субпопуляций, несущих маркеры ТЧК-клеток СБ16+ (21,1 ± 5,0), СВ56+ (19,9 ± 0,7), СЪ57+СВ%+ (10,9 ± 4,0), СБ158а+ (8,1 ± 2,1), за исключением выраженного роста доли 1МХ-клеток с фенотипом СВ161+ (9,1 ± 3,3 при норме 4,4 ± 1,3, р < 0,05).

Система комплемента у больных БКР характеризовалась стабильностью физиологических концентраций практически всех основных компонентов классического и альтернативного путей активации комплимента (показатели С1д, СН50, СЗ, СЗа, С4, С5, С5а, С9 в норме), в то время как у больных МТР (3-я группа) при неизменности большинства тестируемых параметров наблюдался достоверный всплеск содержания С5 (55—100 мкг/мл при норме 48—80) и С5а (29—73 мкг/мл при норме 21—43), что свидетельствует о формировании аутоиммунного синдрома.

Дендритные клетки. У больных БКР отмечено снижение содержания в крови значительной части субпопуляций ДК: с фенотипами СБ1+ (3,3 ± 1,7 во 2-й группе при норме 6,8 ± 1,2), СБШ+ (1,8 ± 0,9 во 2-й группе при норме 3,4 ± 1,0), СБ21+ (1,6 ± 0,8 во 2-й группе при норме 4,2 ± 0,8), СБ27+ (7,2 ± 2,1 и 6,0 ± 4,1 при норме 8,2 ± 2,4), СБ80+ (8,2 ± 2,1 и 8,4 ± 3,9 при норме 11,2 ± 3,4), СБ86+ (10,1 ± 2,0 и 9,8 ± 5,1 при норме 12,0 ± 4,1) достоверно выраженное во 2-й группе больных (р < 0,05), в то время как у больных МТР наоборот отмечен достоверный рост большинства субпопуляций ДК: СБЫ+ — 9,8 ± 3,1, СБ2Г — 8,6 ± 3,6, СБ27+ — 13,2 ± 5,7, СБ80+ — 12,2 ± 4,1, СБ86+ - 16,0 ± 5,2.

Обеднение в периферической крови субпопуляции ДК влечет за собой истощение ресурсов противоопухолевого иммунитета, что мы и наблюдаем у больных БКР. Избыточное накопление ДК, наоборот, приводит к гиперактивации В-звена иммунитета и формированию в дальнейшем комплекса аутоиммунных нарушений, что характерно для группы пациентов с МТР.

Таким образом, из общего числа эффекторных инструментов, ответственных за осуществление функции наследственного звена противоопухолевого иммунитета, наибольший объем нарушений отмечен у больных БКР и, особенно во 2-й группе, проявляющихся в уменьшении популяций клеток, способных реализовывать цитотоксические свойства и/или выполнять функцию киллинга, а также дефектах фагоцитарной функции, проявляющихся обеднением пула фагоцитирующих клеток, что непременно должно привести к дисбалансу в продукции этим клеткам цитокинов (что нашло подтверждение далее) и может играть существенную роль в развитии и прогрессировании опухоли.

Схожесть изменений показателей иммунитета у больных БКР двух групп позволила нам сделать заключение о наличии при БКР синдрома опухолезависимого вторичного иммунного дефицита (СОВИД), а усиление этих показателей во 2-й группе больных — о корреляции этих изменений со стадией опухолевого процесса.

Изменения иммунитета у больных МТР отличались прежде всего появлением признаков аутоиммунных нарушений в виде увеличения содержания С5 и С5а компонентов комплемента, появления ЦИК, аутоан-тител, увеличения субпопуляций ДК и небольшим снижением основных функций наследственного иммунитета, что мы обозначили как синдром опухолевозависимого вторичного иммунного дефицита с аутоиммунными нарушениями (СОВИДАН).

Адаптивный (приобретенный) иммунитет оценивался нами по активности его В и Т-звеньев и процесса апоптоза лимфоцитов в периферической крови.

В-клеточное звено иммунитета.

У больных язвенным БКР выявлено: снижение удельного веса субпопуляций В-клеток с фенотипами CD5+ (9,2 ± 3,4 и 6,7 ± 2,5 при норме 10,7 ± 2,8), CD19+ (9,3 ± 2,2 во 2-й группе при норме 11,8 ± 4,9), CD20+ (9,1 ± 3,3 во 2-й группе при норме 10,2 ± 5,3), CD19+CD20+CD86+ (2,2 ± 0,9 во 2-й группе при норме 3,8 ± 1,6), CD19+CD20+CD28+ (2,0 ± 1,1 во 2-й группе при норме 3,2 ± 1,2), CD22+ (6,1 ± 2,3 во 2-й группе при норме 13,2 ± 1,9) — преимущественно во 2-й группе, а также уменьшение сывороточной концентрации IgG г/л (7,1 ± 3,3 и 6,9 + 3,2 при норме 12,5 ± 5,5). Показатели функциональной активности В-лимфоцитов в тес- 198 тах на пролиферацию (1778—4720 имп/мин и 2133—4592 имп/мин при норме 2000—5000 имп/мининдекс соответственно 4,2—8,3 и 6,2—8,4 при нор-^ ме 5—9) были нормальными, аутоантитела в крови отсутствовали, что свидетельствовало о некоторой гипореактивности В-клеток при БКР. У больных МТР, наоборот, отмечались признаки выраженной гиперактивности В-клеток, проявляющиеся ростом (нередко в 2 раза) большинства субпопуляций В-лимфоцитов, в том числе активированных антителопродуцирующих В-клеток с фенотипом CD19+CD20+CD86+: CD5++ составили 14,4 ± 0,1, CD19+ - 13,8 ± 4,2, CD20+ % - 12,0 ± 5,1, CD23+ % - 4,9 ± 2,8 при нор-&ме 2,7 ± 0,6, CD19+CD20+CD28+ % — 6,0 ± 2,4, CD19+CD20+CD86+ % -7,3 ± 3,9- и увеличением сывороточной концентрации иммуноглобулинов IgM — 2,0 ±1,2 г/л при норме 1,6 ± 0,9 г/л, IgG — 14,4 ±1,2 г/л при норме 12,5 ± 0,5 г/лс тенденцией к формированию ЦИК с 3% ПЭГ — 0,048— 0,062 при норме 0,040—0,045, с 4% ПЭГ — 0,076—0,1 при норме 0,067— 0,079- а также появлением у значительной части больных, особенно с длительным течением заболевания (7 и более лет) ряда аутоАТ (МЕ/мл): анти-В7-Н1 (сумм. IgG 19М): 0,108 ± 0,037 при норме 0,088 ± 0,032, анти-Col (сумм, коллагену) 0,099 ± 0,034 при норме 0,063 ± 0,036, анти-ДНК (IgG) — 71 ± 18 при норме < 50 (1:100), антиДНК (IgM) — 54 ± 10 при норме < * 50 (1:100), антикератиновые (АКА) IgG — 0,092 ± 0,023 при норме 0,065 ± 0,019 и IgM — 0,084 ± 0,038 при норме 0,068 ± 0,032, иллюстрирующих развитие аутоиммунного синдрома.

Т-клеточное звено иммунитета.

У больных БКР 1-й и особенно 2-й группы выявлен дефицит Т* клеточного звена иммунитета, проявляющийся сокращением субпопуля.

— 199 ции общих СБ3±лимфоцитов до 52,2 ±8,9 во 2-й группе при норме 65,2 ± 10,9- количества регуляторных Т-клеток с фенотипами СБ4+ до 35,1 ± 8,4 и 33,1 ± 4,2 при норме 38,2 ± 6,6 (при этом СБ4+СБ25+ — % от СБ4+ Т-клеток-супрессоров составил (16 ±7 и 11±3 при норме 17 ± 3,0) — с тенденцией к росту субпопуляций содержащих маркер поздней активации Т-лимфоцитов ША-БЯ: СБЗНЬА-БК (13,2 ± 4,0 во 2-й группе при норме 10,4 ± 5,1) — СВ4+Н1А-БК+ (10,4 ±4,1 при норме 7,5 ± 2,5) клеток памяти СБ4+СБ45+КО+ (22,2 ± 7,2 при норме 16,5 ± 5,0), а также СБ4+СБ28, лишенных костимуляторной молекулы СБ28 (2,8 ± 1,3 при норме 1,2 ± 0,9).

При этом наблюдается снижение иммунорегуляторного индекса (ИРИ) (С04/СБ8) во' 2-й группе больных БКР до 1,1 ± 0,6 при норме 1,5 ± 0,4 в сочетании с некоторым угнетением пролиферативной активности Т-лимфоцитов на активацию ФГА до 22 933—28 920 имп/мин при норме 30 000—70 000 имп/мин и спонтанной пролиферации лимфоцитов (188—448 имп/мин при норме 250—600 имп/мин).

У больных МТР (3-я группа) выявлен иной характер изменений, демонстрирующих дисбаланс в составе иммунорегуляторных субпопуляций с тенденцией к формированию признаков аутоиммунного синдрома при снижении уровня клеток-супрессоров с фенотипом СБ8+ до 65,5 ± 5,2 при норме 70,3 ± 10,2 и одновременным возрастании доли клеток с фенотипами СБ4+до 42,6 ± 8,2 при норме 38,2 ± 6,6 и СБ4+СБ25+ до 19 + 4 при норме 17 ± 3,0 и соответственно увеличением ИРИ до с.

2,0 ± 0,3 при норме 1,5 ± 0,4- при устойчивом росте субпопуляций несущих основные костимуляторные молекулы СБ21+ (8,6 ± 3,6 при норме 4,2 ± 0,8), СБ23+ (4,9 ± 2,8 при норме 2,7 ± 0,6), СБ80+ (12,2 ± 4,1 при норме 11,2 ± 3,4), СБ86+ (16,0 ± 5,2 при норме 12,0 ±4,1) и экспресси-рующих маркеры ранней активации СБ38+ (49,0 ±11,1 при норме.

42,8 ± 4,9) и СБ69+ (44,2 ±11,1 при норме 38,8 ± 6,9) и вспомогательных молекул для межклеточной кооперации — СБ7+ (4,6 ±2,9 при норме 1,8 ± 0,8), а также значительном росте пролиферативной активности Т-клеток под влиянием митогенов (49 882—92 445 имп/мин, индекс 188— 366 при норме 30 000—70 000 имп/мин, индекс 100—250) в сочетании с увеличением индекса спонтанной пролиферации общей популяции лимфоцитов.

Апоптоз лимфоцитов.

У больных БКР (10й и 2-й групп) в феномен иммуносупрессии су-" щественный вклад вносят усиление процессов апоптоза Т-лимфоцитов, о чем свидетельствуют высокие цифры содержания в крови СБ95+ клеток (49,7 ± 12,1 и 63,7 ± 7,4 при норме 42,7 ± 18,8), экспрессирующих рецептор для Рая-лигандаи увеличение индекса апоптоза С095+/С03 (1,9 ± 0,8 и 2,4 ± 0,9 при норме 1,6 ± 0,4).

У больных МТР отмечен нормальный уровень проапоптотической активности общих Т-лимфоцитов: содержание клеток с фенотипом СБ95+ и индекс апоптоза в норме.

Таким образом, адаптивный иммунитет при СОВИД (у больных БКР) отмечается гиперактивностью В-клеточного и дефицитом Т-клеточ-* ного звеньев, в то время как при СОВИДАН (у больных МТР) выражен перенос акцента на адаптивные механизмы с гиперактивацией В-клеточного звена с признаками аутоиммунного синдрома при дисбалансе в составе иммунорегуляторных субпопуляций с увеличением ИРИ и пролиферативной активности Т-клеток.

Выявленные нарушения иммунитета позволяют полагать, что в патогенезе язвенных БКР и развитии СОВИД весомую роль играет комплекс иммунорегуляторных сдвигов, способных влиять на динамику противоопухолевой цитотоксичности и эволюцию заболевания в целом.

При МТР в отличие от БКР ведущей иммунопатологией является сочетание ВИД с типичными признаками аутоиммунного синдрома (СО-ВИДАН) различной степени выраженности, затрагивающего как эффекк®-1' торные, так и регуляторные звенья иммунитета. При этом в крови больных этой категории повышается содержание маркеров канцерогенеза и пролиферативной активности клеток, что в совокупности требует серьезного анализа.

Можно предположить, что метаплазии базалоидных клеток в атипичные шиповатые при формировании МТР способствуют: усиливающая-ц) ся в ходе хронизации процесса воспалительная реакция стромы с эпизодами изъязвлений и переходом в язвенные варианты течения, сопровождающиеся интенсивной экспрессией опухолью маркеров онкогенеза (ММР, Р53 и др.), пролиферацией и воспалением, что требует превентивной иммунокоррекции дефектов* наследственного и адаптивного звеньев иммунитета, так как развитие и прогрессирование БКР в значительной степени связано с состоянием кооперации 2-звенной системы противоопухолевого иммунитета.

Нами показано, что дисбаланс во взаимодействии этих звеньев, а не селективные дефекты какого-либо из них являются определяющими в развитии язвенных БКР и трансформации их в МТР.

СОВИД характеризуется дефектами, охватывающими по широте как наследственные так и адаптивные звенья иммунитета, степень усиления которых коррелируется с увеличением размера БКР, степенью выраженности изъязвления опухоли и воспалительных изменений.

СОВИДАН отличается появлением аутоиммунных нарушений, провоцируемых неадекватным уровнем кооперации наследственного и адаптивного звеньев иммунитета, затрагивая главным образом адаптивное звено иммунологической реактивности, что характерно для МТР и может быть использовано в технологии клинической иммунодиагностики различных вариантов течения БКР и оценке рисков трансформации процесса в МТР.

Формирование аутоиммунного синдрома, опосредуемое через системы контроля за пролиферационной и апоптотической активностью участвующих в канцерогенезе клеток, ассоциируются с ухудшением клинической картины, включающей признаки усиления агрессивных и метастази-рующих свойств опухоли.

Цитокиновый спектр крови.

Важная роль в регуляции взаимодействия наследственного и адаптивного звеньев иммунитета принадлежит цитокинам. Способностью взаимодействовать с цитокинами, вырабатываемыми макроорганизмом и находящимися в периферическом кровотоке обладают как клетки, обеспечивающие иммунологический гомеостаз, так и клетки опухоли.

Мы оценивали цитокиновый спектр крови в тех же группах больных, что и иммунитет по следующим параметрам: содержанию 12 сывороточных 1Ь, №N-7, ШТЧ-сс, адгезионных молекул — бУСАМ- 1, Ь и Е-селек-тинов, Е и 1Ч-кадхеринов, фактора некроза опухоли ТКБ-а, фактора роста сосудистого эндотелия УЕОБ, фактора контроля дифференцировки и роста кератиноцитов ТСР-(32, хемокинов и субпопуляций ТЫ и ТЪ2 клеток.

1. Содержание сывороточных интерлейкинов у больных БКР при СОВИД отмечается повышением содержания 1Ь-4 мг/мл (151,4 ± 18,1 в 1-й и 239,1 ± 53,1 во 2-й группе при норме 144,6 ± 25,1), 1Ь-5 (27,2 ± 4,4 во 2-й группе при норме 16,1 ± 5,3), 1Ь-6 (11,1 ± 4,2 и 13,1 ± 7,1 при норме 9,8 ± 6,4), 1Ь-8 (20,2 ± 7,9 и 23,4 ± 10,2 при норме 18,8 ± 6,4) 1Ь.

— 203.

10 (77,2 ± 12,9 во 2-й группе при норме 33,4 ± 10,2), 1Ь-18 (88,9 ± 22,5 во 2-й группе при норме 79,2 ± 13,6). При выраженной тенденции к снижению содержания 1Ь-1р (26,8 ±9,3 во 2-й группе при норме 38,8 ± 8,6), 11.-7 (9,2 ± 3,2 во 2ой группе при норме 11,2 ± 4,4), 1Ь-9 (11,2 ± 6,6 во 2-й группе при норме 14,9 ± 6,6), 1Ь-12 (37,4 ± 10,8 во 2-й группе при норме 54,4 ± 11,3) и 1Ь-21 (8,4 ± 3,9 во 2-й группе при норме 10,0 ± 2,6), преимущественно у больных 2-й группы с большим размером опухоли и II—III степени изъязвления.

У больных МТР с СОВИДАН сохранено и резко усилено увеличе-Ч> ние содержания 1Ь-5 (39,9 ± 9,1), 1Ь-6 (68,2 ± 9,0), 1Ь-8 (49,4 ± 19,1), 1Ь-18 (122,2 ± 36,0), превысившее норму в 2—6 раз 1Ь-10 (44,4 ± 18,2) увеличен, но в меньшей степени, а содержание 1Ь-1р в отличие от СОВИД (57,2 ± 22,1) и 1Ь-12 (70,0 ± 6,4) существенно увеличилось, превыся норму. Концентрация же 1Ь-7 (5,1 ± 1,0), 1Ь-9 (8,3 ± 2,5), 1Ь-13 (2,2 ± 1,7 при норме 9,2 ± 2,9) и 1Ь-21 (3,1 ± 1,1), как и во 2-й группе больных БКР с СОВИД, была сниженной, причем в более значительной степени.

Таким образом выявленные изменения свидетельствуют о дисбалансе в содержании интерлейкинов. Поскольку их изменения находятся в тесной взаимосвязи с содержанием сывороточных интерферонов и субпопуляций ТЫ и ТЫ клеток, продуцентами которых являются ряд интерлейкинов проведем их анализ совместно.

2. Содержание сывороточных интерферонов у больных БКР и МТР во всех группах было снижено: КБ-у базальный в сыворотке пг/мл (40,0 ± 19,1 во 2-й группе, 23,1 ± 12,3 в 3-й группе при норме 52,0 ± 12,3) — ШР-а базальный в сыворотке пг/мл (25,7 ± 14,9 во 2-й группе, 22 ± 16,2 — в 3-й группе), отражая феномен совокупного дефицита 2-х интерферонов, подробная динамика которого приведена в разделе «Лечение» (см.).

3. Содержание субпопуляций Thlи ТЪ2-клеток в крови больных проявилось при БКР и МТР снижением индекса Thl/Th2 (0,4 ± 0,25 во 2-й группе и 0,37 ±0,19 — в 3-й группе при норме 0,98 ± 0,23), главным образом за счет уменьшения субпопуляции Thl лимфоцитов при БКР, что сочетлось при МТР с ростом доли регуляторных клеток Th2 при МТР.

Известно, что инфильтрат, окружающий ткань опухоли БКР и МТР состоит преимущественно из Т-хелперов, которые секретируют Th-1 и Th-2 зависимые цитокины, участвующие различными путями в регуляции противоопухолевого иммунного ответа (Bottomyk et al, m 1989, Dohlsten M. et al., 1988, Habet I. 1998, Markey A. C. et al., 1990, Wong D. A. et al., 2000).

Вырабатываемые ТЫ-лимфоцитами IL-12 и ИФН-у определяют специфику клеточно-опосредованного ответа, являясь при этом факторами роста и индукторами цитотоксических лимфоцитов (в том числе Nk-клеток). Секретируемые Th2-лимфоцитами IL-4, IL-5 и IL-10 в основном воздействуют на В-звено иммунитета, активируя пролиферацию и синтез В-клетками антител.

При БКР выражено уменьшение доли Thl-клеток, как показали наши исследования, что сопровождалось подавлением секреции IL-12 и ИФН-у, что в свою очередь сопровождалось угнетением состояния цито-токсичности из-за недостаточной стимуляции (уменьшение LAK клеток, ЕЦТ, снижение ЦИ, NK-клеток субпопуляций CD16+, CD50+, CD57+, CD58+, CD161+), что мы видим при анализе наследственного звена иммунитета. Т-клеточная активация не возможная без участия ДК клеток и IL-lp продукция котор>ых при БКР снижена, что ведет к недостаточной стимуляции В-звена адаптивного иммунитета через IL-lp приводя, как мы видели к его гипофункции (снижено содержание субпопуляций В-кле-ток — CD5, CD19, CD20, иммуноглобулина IgG, хотя функциональная ^ активность В-лимфоцитов сохраняется в пределах нормы, что, по-видимому, обусловлено достаточно высокой активностью ТЪ-2 ответа с увеличением продукции 1Ь-10, активизирующего В-лимофоциты. Сниженный ^ уровень 1Ь-21 сопровождается недостаточной стимуляцией наследственного звена иммунитета (снижены фагоцитарная функция, цитотоксиче-ская и ДК), а также ИФНу, стимулятором которых 1Ь-21 обычно является. Снижение содержания 1Ь-7, 1Ь-9 и 1Ь-12 (продуцируемого ДК, моноцитами) ослабляют процессы дифференцировки клеток и цитотоксиче-ские реакции, что мы и наблюдаем у больных БКР на фоне совокупного дефицита ИФНу и ИФНа.

ТЬ-2 ответ, связанный с продукцией 1Ь-4, 1Ь-5, Ш-10 сохранен и даже несколько увеличена продукция перечисленных интерлейкинов главным образом за счет 1Ь-10 (в 2 раза), что обсуловливает его митоген-ный и ангиогенный эффект на опухоль, а 1Ь-6 и 1Ь-8 также несколько повышенного содержания способствуют подавлению апоптоза опухолевых клеток.

Таким образом индекс Т1г-1/Т11−2 уменьшен при БКР, главным образом, за счет уменьшения ТЬ-1.

Иная картина наблюдается при МТР, при котором индекс ТИ-1 /ТЬ-2 тоже снижен, но главным образом за счет повышения ТИ-2.

При МТР как мы показывали, рост доли ДК сочетается с ростом концентрации в крови 1Ь-1|3. Наблюдаемый феномен может быть связан с природой самой опухоли, секретирующей собственный 1Ь-1(3, который не только индуцирует противоопухолевый иммунитет, но и участвует в формировании инвазивных форм опухоли, в трансформации БКР и МТР с изменением иммунологического фенотипа.

ДК и 1Ь-1|3, увеличенный при МТР на 20% способствуют гиперактивности В-звена адаптивного иммунитета, сопровождаясь как мы пока-4 зали, увеличением субпопуляций В-клеток в несколько раз, увеличением концентрации 1§-С,^М, появлением ЦИК, аутоантител, т. е. развитию аутоиммунного синдрома. Стимуляции В-звена способствуют 1Ь-5 (в 2 раза выше нормы), ТЕ-10 (в 4 раза выше нормы), что стимулирует Т1г-2 ответ и такое резкое увеличение 1Е-10 оказывает на опухоль гораздо более сильный митогенный и ангиогенный эффект. Последний усиливается 1Ь-6 и 1Ь-8, содержание которых соответственно в 6 раз и в 3 раза выше нормы, при этом помимо ангиогенного действия 1Е-6 подавляет апоптоз опухолевых клеток, что способствует в совокупности повышению агрессивности опухоли и может быть использовано для иммунодиагностики МТР в совокупности с другими иммунологическими критериями. Содержание 1Ь-7 и 1Ь-9 продуцируемых кератиноцитами, снижено при МТР в 2 раза, что приводит к дефициту их положительного влияния на дифференциров-ку клеток и ослаблению противоопухолевого иммунитета.

1Ь-13 относят к категории цитокинов с противоопухолевыми свойствами. При МТР его концентрация уменьшается в 4 раза, в то время как при БКР сохраняется в пределах нормы, демонстрируя ассоциативность этого процесса с опухолевой прогрессией и агрессивностью опухоли создавая условия смены фенотипа СОВИД на СОВИДАН и метаплазии база-лоидных клеток. 1.

4. Содержание адгезионных молекул в сыворотке крови (нг/мл) во 2 и 3 группах больных БКР с СОВИД и МТР с СОВИДАН имело тенденцию к снижению: бУСАМ-1 — 221,1 ± 77,8 во 2-й группе, 1.41,2 ± 38,8 в 3-й группе при норме 243,2 ± 54,2- Ь-селектин — 249,2 ± 77,8 во 2-й группе, 154,8 ± 43,7 в 3-й группе при норме 288,1 ± 98,5- Е-селектин — 132,2 ± 66,7 во 2-й группе, 199,1 ± 44,0 — в 3-й группе при норме 142,5 ± 35,1. Е-кадхерин — 16,2 ± 6,4 во 2-й группе, 18,8 ± 9,4 — в 3-й группе при норме 24,0 ± 8,1- за исключением ]Ч-кадхерина, содержание которого несколько повысилось.

Снижение концентрации адгезинов, селектинов и Е-кадхедина свидетельствует о недостаточности ресурса в составе адгезионного пула для сохранения стабильности стромальной архитектоники в ходе развития опухоли, особенно при МТР.

Повышение 1Ч-кадхерина в кровотоке, отмеченное нами при БКР и МТР, коррелирует с ростом агрессивности опухоли (56,0 ± 9,9 нг/мл при МТР, 39,2 ± 14,3 нг/мл при БКР при норме 19,4 ± 6,2 нг/мл), так как известно, что 1Ч-кадхерин участвует в миграции опухолевых клеток за счет взаимодействия с клетками стромы и эндотелия.

5. Содержание эндогенных факторов (пг/мл): Т№-а — существенно увеличилось у больных МТР с СОВИДАН до 89,9 ± 35,1, при норме 56,4 ± 28,8. УЕвБ (фактор роста сосудистого эндотелия) — до 255,9 ± 47,6 при норме 122,2 ± 27,2. Во 2-й группе с СОВИД УЕОБ составил 200,2 ± 54,2. ТОР (32 несколько снижен во 2-й и особенно 3-й группе (16,4 ± 8,2 при норме 39,9 ± 13,1).

Мы выявили обратную корреляцию между содержанием в крови.

ТОБ-рз, активно участвующего в контроле дифференцировки и роста кеч ратиноцитов, и степенью инвазивности опухоли: показатели значительно снижались по мере ее прогрессирования и усиления агрессивных свойств (34,5 ± 10,1 нг/мл при БКР в 1-й группе, 28,1 ± 12,0 нг/мл во 2-й группе больных и 16,4 ± 8,2 нг/мл — при МТР в 3-й группе при норме 39,9 ± 13,1 нг/мл). Для инвазивности опухоли большое значение имеют такие факторы сосудистого эндотелия и в частности — УЕОБ-1, определяющий состояние проницаемости сосудов и неоваскуляризации. Мы выявили повышение содержания УЕОР-1 коррелирующее с усилением агрессивности опухоли: при БКР в 1-й группе больных его содержание в крови 120,7 ± 54,2 нг/мл, во 2-й группе 200,2 ± 54,2 нг/мл, а у больных с МТР в 3-й группе больных — 255,9 ± 47,6 нг/мл, р < 0,05, т. е. в 2 раза превышает норму. Таким образом, этот показатель может быть также использован для оценки агрессивности опухоли и дифференциации БКР с МТР.

6. Содержание хемокинов в сыворотке крови (мг/мл) увеличивалось у 2-й группы больных БКР и МТР — КАЭТЕБ и 1Ь-8. Во 2-й группе больных с БКР ЫАОТЕБ увеличился до 79,3 ± 12,3 и у больных МТР (3-я группа) до 104,8 ± 32,8 при норме 68,9 ± 22,3, значение 1Ь-8 повышалось до 29,4 ± 10,2 у больных 2-й группы и 49,4 ±19,1 — в 3-й группе при норме 18,8 ± 6,4.

4) Указанные хемокины играют важную роль для опухолевой прогрессии, клеточной пролиферации и ангиогенеза. Ситуация с хемокином МСР-1 — хемотоксическим белком макрофагов иная — у больных МТР его концентрация снижается (128,9 ± 33,9 пг/мл при норме 233,4 ± 88,6 пг/мл, р < 0,05), что ведет к редукции хемотаксиса и направленной миграции макрофагов.

Таким образом, помимо патогенетической значимости цитокинов, в развитии БКР и МТР, обеспечивающих взаимодействие между наследственным и адаптивным звеньями иммунитета, они могут быть использованы в иммунодиагностике для оценки агрессивности опухоли и дифферен-^ циальной диагностики БКР и МТР, а также для решения вопросов иммунотерапии, что нашло отражение в разработанном нами методе лечения этих опухолей.

Лечение больных язвенной БКР и МТР.

Мы разработали способ лечения БКР (патент на изобретение № 2 229 306), заключающийся в использовании препаратов рекомбинатного интерферона а2 (реаферона, интрона А) в виде внутритканевых обкалываний опухолевых очагов в дозе 1,5—2 млн МЕ через, день, 15—20 млн МЕ на курс в сочетании с вифероном в свечах в дозе 1 млн МЕ/сутки, 10 млн МЕ — на курс и геля местно. Последействие курса терапии продолжалось в течение 8 недель, после чего оценивался эффект терапии. В случае неполного удаления опухоли курс лечения повторялся. Всего лечение проведено 51 больному, у 39 из которых диагностирован язвенный БКР, у 12 — МТР. Опухоли в стадии Т^Мо составили 32 случая, при этом размеры опухоли до 1 см I степени изъязвления наблюдались в 7 случаях (6 БКР + 1 МТР), от 1 до 2 см I степени изъязвления в 9 случаях (8 БКР + 1 МТР) и II степени — в 16 случаях БКР. Опухоли в стадии Т2К0М0 (2— 5 см в диаметре) наблюдались в 15 случаях, при этом II степень изъязвления отмечена в 8 (5 БКР + 3 МТР), III степень — в 7 (4 БКР + 3 МТР) случаях. Опухоли в стадии Т31ч[0М0 (более 5 см) наблюдались в 4 случаях, при этом II степень изъязвления отмечена у 2 больных МТР, III степень у 2 больных МТР. Моноинтерферонотерапию в виде разработанного нами метода получили с результатом (клинического и цитологического) выздоровления.

25 больных при этом 22 из них страдали БКР и лишь 2 — МТР. По характеристике 22 опухоли были в стадии Т^оМо. I—II степени изъязвления и 3 — Т2К0М0II степени изъязвления. При этом при Т^0М0 (до 1 см) I степени изъязвления (среди них был 1 случай МТР) потребовался 1 курс лечения в 9 случаях (7 БКР — Т^Мо (1—2 см) I степени изъявления, 1 МТР Т^оМо (1,5 см) II степени изъязвления — 2 курса моноинтерфере-нотерапии. В 9 случаях (7 БКР — Т^Мо II степени изъязвления и 2 БКР.

Т^оМо II степени изъязвления) потребовалось 3 курса моноинтерфере-нотерапии. Таким образом (таблица) во всех 7 случаях (6 БКР + 1 МТР) с характеристикой Т^Мо (до 1 см) I степени изъязвления получено излечение после 1 курса моноинтерференотерапии. Из 25 опухолей с характеристикой Т1Ч0Мо (1—2 см) I—II степеней изъязвления в 15 случаях на-^ блюдалось излечение после 2—3 курсов моноинтерференотерапии (60% случаев). При характеристике опухоли T2N0M0 II степени изъязвления только в 20% случаев достигнуто выздоровление после 2—3 курсов моноинтерференотерапии.

Комплексное лечение получили 26 больных (16 БКР + 10 МТР) преимущественно с характеристикой опухоли Т2—T3N0M0 II—III степени изъязвления. При этом (после I курса интерференотерапии достигнуто ш уменьшение на 20—50% размера опухоли и степени изъязвления, после чего 2 больным произведена криодеструкция, 2—ФДТ. 2 курса моноинтерференотерапии получили 12 больных БКР, при этом у 7 больных, после уменьшения опухоли на 50—70% произведена криодеструкция, 5 больных получили 2 курса комплексного лечения, включающих помимо препаратов интерферона по разработанному нами методу проспидин 100 мг (1,5—2,0 г на курс), после чего достигнуто выздоровление- 8 больных МТР получили 3 и 2—4 таких комплексных курса терапии, в результате чего у всех больных достигнуто излечение. При этом отмечена положительная динамика уровня ИФНа и ИФНу в сыворотке крови, ликвидировавшая дефицит интерферонов, выявленный до лечения.

Наблюдение за больными в сроки от 2 до 3-х лет не выявило рецидива заболевания, в связи с чем мы считаем, что рекомбинантные препараты интерферона а2 в виде предложенной нами методики внутритканевой терапии могут быть успешно использованы в моноили комплексной терапии БКР и МТР, что является патогенетически обоснованным. При этом моноинтерференотерапия разработанным нами методом высокоэффективна в случаях язвенных БКР в стации Т^0М01—II степеней изъязвления. При язвенных БКР с характеристикой Т2—T3N0M0 II—III степеней изъязвления и МТР (Т!—Т3^М0) целесообразно включение ее в комплексное лечение, в которое особенно при МТР целесообразно включать проспидин, учитывая его эпидермотропность.