Проточная цитометрия

МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Челябинский государственной университет»

(ФГБОУ ВПО «ЧелГУ»)

Биологический факультет

Реферат

Тема: «Проточная цитометрия»

Челябинск

2014 г.

1. Проточная цитометрия

2. Принцип метода

3. Параметры, клеток регистрируемые при помощи проточного цитометра

4. Некоторые, термины, часто использующиеся в проточной цитометрии

5. Преимущества

6. Применение Литература

Возможности применения методов количественной цитометрии в биологических и медицинских исследованиях очень широки. Они включают множество задач, начиная от поиска наиболее информативных морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики ДНК в клеточном цикле и кончая многопараметрическим изучением гетерогенных популяций исследуемых объектов.

В настоящее время цитометрию принято подразделять на проточную и статическую. Первый вариант цитометрии осуществляется с помощью специальных приборов — проточных цитометров и сортеров. Для статической цитометрии могут быть использованы конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах. Существует много методик, которые с одинаковым успехом можно воспроизводить как с помощью проточной, так и статической цитометрии. Более того, статическая цитометрия в некоторых случаях позволяет получить более обширную информацию о клетках, причем ее производительность не намного меньше проточной.

1. Проточная цитометрия

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Основа метода заключается в:

1) использовании системы гидрофокуссировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке;

2) облучении клетки лазерным излучением;

3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

За образцы берут кровь, костный мозг, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, асцитическая жидкость, суспензированные клетки тканей (например, опухолей).

2. Принцип метода

Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом (т.н. гидродинамическое фокусирование).

Рис. 1

Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рассеянное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм.

3. Параметры, клеток регистрируемые при помощи проточного цитометра

Рис. 2

Прямое (малоугловое) светорассеяние — forwardscatter.

Детектор прямого светорассеяния располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и регистрирует излучение разера, которое рассеивается под углами 2−19 градусов. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Более крупные клетки рассеивают свет сильнее мелких.

Боковое светорассеяние — sidescatter.

Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Комбинация бокового и прямого светорассеяния позволяет судить о морфологии клетки в целом, выделять различные популяции клеток (лимфоциты, моноциты, гранулоциты) для дальнейшего анализа.

Рис. 3

Рис. 4

Регистрация флуоресценции.

Система для регистрации свечения флюоресцентных меток состоит из комплекса светофильтров и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в диапазоне длин волн, соответствующих флуорохрому. Выбор типа и количества флуоресцентных красителей определяется поставленной зачачей для данного исследования. Основными типами таких красителей являются моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой (FITC, PE, APC, PerCP и др.) для определения мембранных и цитоплазматических антигенов клетки, красители, позволяющие оценить жизнеспособность клеток (7AAD, PI) флуорофоры, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (DAPI, Hoechst), pH-чувствительные флуорофоры (Fluo-3), ион-зависимые флуорофоры (Indo-1).

Полученные данные обрабатываются компьютером и отображаются в виде одномерных гистограмм или двухи трехмерных точечных или плотностных графиков. Анализ данных позволяет определить количество клеток, отвечающих тем или иным условиям, оценить интенсивность флуоресценции (т.е. плотность того или иного маркера на поверхности клетки). В некоторых случаях при помощи проточного цитометра можно определить абсолютное число клеток в исследуемом образце.

Рис. 5

Сортировка клеток.

В проточномцитометре, оборудованном системой для сортировке клеток, проточная ячейка закреплена на пьезокристалле. При подаче на него напряжения кристалл вместе с ячейкой совершает колебания с заданой частотой, в результате чего струя жидкости с клетками разбивается на отдельные капли. Проходя сквозь заряжающее кольцо, капля может приобретать положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, какая клетка содержится внутри капли. Пролетая мимо отклоняющих пластин капля с клеткой притягивается к ним, выходит из основного потока и попадает в пробирку.

Преимуществами сортировки клеток на проточномцитометре является высокая чистота получаемой популяции клеток (до 99.9% позитивных клеток в отсортированной фракции), возможность сортировать клетки по любым комбинациям детектируемых параметров. Данный метод позволяет отсортировывать любое количество клеток, вплоть до единичных клеток, что является незаменимым в технологиях связанных с клонированием. Проходя через системы прибора клетки подвергаются некоторым неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления) что несколько снижает процент жизнеспособных клеток на выходе по сравнению с исходным материалом. Также при сортировке на проточном цитометре бывает затруднительным соблюдение абсолютной стерильности, что ограничивает применение данного метода в клинической практике.

4. Некоторые, термины, часто использующиеся в проточной цитометрии.

цитометрия гейтирование клетка флуоресценция Компенсация.

Настройка прибора для исключения паразитного свечения флюорохрома в соседних каналах. Характеристики установленных на проточном цитометре светофильтров таковы, что их область пропускания соответствует максимуму спектра испускания флуорофора. Но за счет того, что спектр испускания флуорофора может быть достаточно широким, часть его излучения может проходить сквозь другие светофильтры, настроенные на регистрацию излучения дрогогофлуорофора. То есть к примеру некоторая доля излучения от красителя FITC будет регистрироваться в канале, предназначенном для фикоэритрина, искажая результаты измерения. Для исключения данного эффетка необходимо уменьшать сигнал с детектора пропорционально сигналу с соседнего детектора, компенсируя таким образом паразитное свечение соседних флуорохромов. Величина компенсации зависит от многих параметров: напряжения на фотоумножителе и как следствие его чувствительности, спектра используемых флуорохромов, производителя реактивов (меченые антитела от разных производителей имеют разное соотношение белок/флуорофора, соответственно одни и те же образцы окрашенные различными антителами будет давать сигналы разной интенсивности).

Дискриминатор.

Функция, благодаря которой не регистрируются события, не удовлетворяющие какому-либо условию. Чаще всего данная функция используется для того чтобы не регистрировать объекты имеющие маленький размел, то есть исключить из анализа частицы разрушенных клеток, тромбоциты, другие мелкие посторонние объекты. Благодаря использованию дискриминатора уменьшается нагрузка на компьютер прибора, повышается его быстродействие, уменьшается размер записываемых файлов, что облегчает последующий анализ данных. Дискриминатор должен быт настроен таким образом, чтобы отсекать большую часть дебриса, но при этом не захватывать область, содержащую интересующие исследователя события.

Пробоподготовка образцов.

В качестве образцов для исследования на проточном цитометре могут использоваться различные суспензии клеток и биологические жидкости. Для проведения исследования на проточномцитометре необходимо минимизировать количество частиц в исследуемой суспензии, которые могут затруднить анализ. Чаще всего такими частицами являются эритроциты в образцах крови или костного мозга, тогда как объектом исследования выступают лейкоциты. Получение лейкоцитарной суспензии возможно несколькими способами. Во-первых можно лизировать эритроциты каким-либо химическим агентом, разрушающим мембрану эритроцита (наиболее распространенным является 0,9% раствор хлорида аммония). Вторым распространённым способом получения лейкоцирарной суспензии является центрифурирование в градиенте плотности (например выделение мононуклеарной фракции из крови при помощи центрифугирования на фиколе).

Неспецифическое связывание антител.

На точечной диаграмме неспецифическое связывание выглядит в виде «хвоста», тянущегося от двойной негативной популяции под углом 45 градусов в верхний правый угол. Неспецифической связывание характерно для образцов с большим содержанием погибших клеток, а также для клеток, имеющих на поверхности Fc-рецептор (в основном, клетки, способные к фагоцитозу). Для борьбы с данным феноменом следует перед окрашиванием антителами обрабатывать клетки специальными реагентами для блокировки Fc-рецептора, проводить подготовку образцов таким образом, чтобы минимизировать гибель и разрушение клеток в процессе пробоподготовки. Также при анализе полученных данных нужно стараться чтобы в регион анализа попадало как можно меньше погибших клеток и дебриса.

Логическое гейтирование.

Основной метод анализа цитометрических данных заключается в выделении какой-либо популяции клеток, и дальнейшего анализа событий, относящихся только к интересующей популяции. Гейтирование может производиться по любым регистрируемым параметрам и с использованием любых логических операторов и их комбинаций (И, ИЛИ, НЕ). На представленном примере сперва производится гейтирование по CD45 позитивным событиям выделение лейкоцитарной популяции и отсев дебриса. Следующим шагом идет выделение лимфоцитарной популяции по параметрам прямого и бокового светорассеяния. И уже после двойного гейтирования по CD45 и лимфоцитарному региону происходит заключительный этап анализа — определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов.

5. Преимущества

Короткое время анализа за счет высокой скорости (до 100 000 событий в секунду),

анализ большого количества клеток (до 108 клеток в мл),

определение субпопуляций клеток, измерение параметров редко встречающихся клеток, объективное измерение интенсивности флуоресценции.

6. Применение

Иммунология:

иммунофенотипирование клеток периферической крови, определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей),

определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа),

определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов, определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина),

исследование клеточного цикла, оценка клеточной цитотоксичности.

Онкология:

количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК),

анализ стадий клеточного цикла, выявление анеуплоидного клона, определение пролиферативной активности анеуплоидного клона, определение специфических маркеров, позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска, оценка состояния иммунной системы, оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов),

оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.).

Цитология:

определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток, оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов, определение экспрессии поверхностных антигенов, анализ стадий клеточного цикла, измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны).

Гематология:

анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови, подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам, дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов, диагностика лимфопролиферативных заболеваний, диагностика острых лейкозов, оценка минимальной резидуальной болезни.

Фармакология:

измерение экспрессии маркеров, измерение активности внутриклеточных ферментов, определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне.

Растениеводство / Сельское хозяйство:

определение плоидности клеток, анализ клеточного цикла, анализ и сортировка протопластов.

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10−100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (invivo или invitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

1. Davey H. Flow cytometry for clinical microbiology. CLI 2004; 2/3:12−5.

2. Shapiro H.M. «Practical Flow Cytometry», Alan Liss, .N.Y., 1985.

3. Принцип метода [Электронный ресурс]. — http://www.ckpgene.ru/left/protochnaya_citometriya/