Материалы и методы

полиморфный маркер артериальный гипертензия В работе использованы образцы крови 261 донора без клинических проявлений и диагнозов ЭАГ и ИБС (контрольная группа), 233 образца крови больных с диагнозом ЭАГ и 226 образцов крови больных с диагнозом ИБС. Диагнозы ЭАГ и ИБС устанавливали в соответствии и с учётом клинических рекомендаций ВНОК. Средний возраст пациентов с диагнозом ЭАГ составлял 59,4±14,1 лет, с диагнозом ИБС — 61,8±13,6 года. Средний возраст людей из контрольной группы составлял 55,0±17,4 года. ДНК выделяли из 200 мкл венозной крови пациентов с помощью набора для выделения геномной ДНК AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit («Axygen», США) согласно инструкциям производителя.

Участок гена СLOCK, содержащий маркер 3111ТC, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со следующими праймерами: прямой 5'-tccagcagtttcatgagatgc-3', обратный 5'-gaggtcatttcatagctgagc-3' («Синтол», Россия) [Desan et al., 2000]. Смесь для амплификации содержала по 10 пМ каждого из праймеров, 2мкл 10ЧПЦР буфера, 1 мМ каждого dNTP и 0.5 ед. Taq-полимеразы («Силекс», Россия). ПЦР проводили на приборе Robocycler («Stratagene», США) по программе: 3 мин денатурация при 94 °C, а затем 35 повторяющихся циклов в режиме: 94 °C — 1 мин, 59 °C -1 мин, 72 °C — 1мин. Полученный ПЦР продукт (220 п.н.) подвергали обработке рестриктазой MhlI («Сибэнзим», Россия) для идентификации аллелей T (220 п.н.) и C (125 и 95 п.н.) (рис. 1). Условия проведения ПЦР и рестрикции описаны ранее [Desan et al., 2000].

Участок гена СLOCK, содержащий маркер 843ТС, амплифицировали со следующими праймерами: прямой 5'- atttatcaggctttcaaggtca-3', обратный 5'-atgggagtccaggatttatt-3' («Синтол», Россия). Праймеры сконструированы с помощью программы Primer Premier 5. Смесь для амплификации содержала по 10 пМ каждого из праймеров, 2мкл 10ЧПЦР буфера, 1 мМ каждого dNTP и 0.5 ед. Taq-полимеразы («Силекс», Россия). ПЦР проводили на приборе Robocycler («Stratagene», США) по программе: 3 мин денатурация при 94 °C, а затем 35 повторяющихся циклов в режиме: 94 °C — 1 мин, 62 °C -1 мин, 72 °C — 1мин. Полученный ПЦР продукт (575 п.н.) подвергали обработке рестриктазой RsaI («Сибэнзим», Россия) для идентификации аллелей T (427 и 156 п.н.) и C (295, 132 и 156 п.н.) (рис. 2).

Продукты рестрикции разделяли в 6%-ном полиакриламидном геле, окрашенном бромистым этидием, и визуализировали с помощью системы Kodak EDAS 290 («Kodak», США). Статистический анализ данных осуществляли с помощью пакета программ MS Excel. Достоверность различий частот аллелей и генотипов в группах оценивали с помощью критерия ч². Достоверным считали уровень значимости p < 0.05. Для оценки риска заболевания рассчитывали соотношение шансов OR.