Питательные среды. 
Клеточные культуры

В любой клеточной культуре различают клеточную и жидкую фазы. Жидкая фаза обеспечивает жизнедеятельность клеток культуры и представляет собой питательные среды различного состава и свойств.

Все среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя на поверхности стекла или достаточно высокую концентрацию клеточных элементов в суспензии (при получении суспензионных культур). Поддерживающие среды фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетках вирусных агентов.

Ростовые и поддерживающие среды многокомпонентны. В их состав могут входить как естественные продукты (амниотические жидкости, сыворотки животных), так и субстраты, полученные в результате частичной обработки естественных продуктов (эмбриональные экстракты, гидролизат лактальбумина, гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические химически чистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).

В качестве примера питательной среды, полностью состоящей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для выращивания клеточных культур из почечного эпителия обезьян. В эту среду входит коровья амниотиче-ская жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) и коровий эмбриональный экстракт (5%).

Все естественные продукты малостандартны, их использование связано с большой опасностью микробной и вирусной контаминации клеточных культур. В связи с этим и происходит постепенное вытеснение их синтетическими стандартными смесями. Наибольшее применение находят синтетическая среда 199 и среда Игла. Широко используются среды, содержащие строго определенные количества солей, аминокислот и витаминов.

Независимо от назначения все питательные среды для тканевых культур конструируются на основе какого-либо сбалансированного солевого раствора с достаточной буферной емкостью. Чаще всего ими являются растворы Хенкса и Эрла. Эти растворы — обязательный компонент любой питательной среды. Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5—10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит.

Включение сыворотки в то же время препятствует созданию ростовых сред точного химического состава, весьма важных для развития фундаментальных исследований по клеточной физиологии, так как вместе с сывороткой (или ее дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемых факторов, варьирующих в зависимости от серии сыворотки.

В 50-е годы Ewans и Waymouth были предложены бессывороточные среды точного химического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех показателей пролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды с добавлением сывороток. В связи с этим представляет интерес работа Birch и Pirt, показавших, что для обеспечения интенсивного роста клеток в бессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей Fe, Zn, Cu, а также МnС1₂.

В ростовые питательные среды, а так же в буферный раствор для промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в среду непосредственно перед употреблением из расчета 1 мл основного раствора антибиотиков на 500 мл среды.

Ниже приведен состав и метод приготовления одной из распространенных питательных сред.

Среда Игла л-аргинина — 17,4.

л-цистина — 4,8.

л-гистидина — 3,1.

л-изолейцина — 26,2.

л-лейцииа — 13,1.

л-лизина — 14,6.

л-метионина — 7,5.

л-фенилаланина — 8,3.

л-треонина — 11,9.

л-триптафана — 2,0.

л-тирозина — 18,1.

л-валина — 11,7.

биотина — 0,24.

холина — 0,12.

холин-хлорида — 0,14.

витамина В₁₂ (птероилглютаминовой кислоты) — 0,44.

никотинамида — 0,12.

пантотеновой кислоты — 0,22.

пантотената кальция — 0,48.

пиридоксаля (пиридоксин хлоргидрата) — 0,20.

тиамин-хлоргидрата — 0,34.

рибофлавина — 0,04.

хлористого натрия — 5850,0.

хлористого калия — 373,0.

фосфата натрия однозамещенного (NaH₂PO₄ ^. Н₂О) — 138,0.

кальция хлористого — 111,0.

двууглекислого натрия (NaHCO₃) — 1680,0.

магния хлористого (MgCl₂ ^. 6Н₂О) — 102,0.

глюкозы — 900,0.

л-глютамина — 146,2—292,3.

пенициллина — 50,0.

стрептомицина — 50,0.

фенола красного — 5,0.

воды до 1000,0.

Приготовление.

Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80°, помешивая, растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-глютамин и фенол-красный.

Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за исключением двууглекислого натрия (NaHCO₃), смешивают с предыдущим раствором неорганических солей и добавляют биотин и витамин B₁₂.

Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и птеро-илглютаминовой кислоты, и антибиотики — пенициллин и стрептомицин. Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтр-нутч (пористая стеклянная пластина, величина пор 0,7—1,5) либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца после предварительного промывания водой, а затем — приготовленным раствором.

500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1 мг инозита на 1 л.