Экспериментальное моделирование гипоксии in vitro

Моделирование нормобарической гипоксии in vitro

Моделирование нормобарической гипоксии проводилось на 33 день развития культуры in vitro (DIV) путем замены нормоксической культуральной среды на среду с низким содержанием кислорода в течение 10 минут. В опытных группах за 20 минут до гипоксии в культуральную среду добавляли BDNF в конечной концентрации 1 нг/мл. В контрольную группу вошли культуры, которым гипоксия проводилась без превентивного добавления нейротрофического фактора.

Для получения культуральной среды с обедненным содержанием кислорода использовался герметичный сосуд, в котором воздух был замещен на инертный газ — аргон. Аргон способен вытеснять кислород из жидкостей, так как имеет большую растворимость, чем кислород. По своим химическим свойствам аргон не способен вступать в химические реакции, что обеспечивает идеальные условия для проведения эксперимента.

Для приготовления среды с низким содержанием кислорода использовалась установка, представленная на рисунке 6.

Из баллона с инертным газом по газоотводной трубке, на конце которой находилась игла, под давлением 1−1,5 МПа аргон проходил через культуральную среду в герметичном сосуде. Для того, чтобы в сосуде не накапливалось избыточное давление, выше уровня жидкости находился конец второй газоотводной иглы, которая была соединена с выходящей газоотводной трубкой (Ведунова М.В. c cоавт., 2012, Ведунова М. В. c cоавт., 2013).

Для оценки эффективности вытеснения кислорода из культуральной среды определяли концентрацию растворенного кислорода методом йодометрического титрования (Лурье Ю.Ю., 1973).

Рисунок 6. Установка для приготовления культуральной среды с низким содержанием кислорода. 1- баллон с газом (аргоном), 2 — кран газового баллона, 3- редуктор, 4,9 — газовые шланги, 5 — игла для приведения газа, 6 — сосуд для обработки среды, 7- культуральная среда, 8 — газоотводная игла.

Метод Винклера основан на способности гидроксида марганца (II) окисляться в щелочной среде до гидроксида марганца (IV), количественно связывая при этом кислород. В кислой среде гидроксид марганца (IV) снова переходит в двухвалентное состояние, окисляя при этом эквивалентное связанному кислороду количество йода. Выделившийся йод оттитровывают раствором тиосульфата натрия в присутствии крахмала в качестве индикатора.

MnCl2 + 2 NaOH = Mn (OH)2 + NaCl,.

2 Mn (OH)2 + O2 + 2 H2O = 2 Mn (OH)4,.

Mn (OH)4 + 2 H2SO4 + 2KI = I2 + 4H2O + MnSO4 + K2SO4,.

I2 + 2Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6.

Точность метода составляет ±0,1 мг/л (Лурье Ю.Ю., 1973).

Поскольку в среде содержится ph-зависимый краситель, конечную точку титрования определяли с помощью спектрофотометра Synergy MX (BioTek).

Исходное содержание растворенного кислорода в культуральной среде, определяемое по методу Винклера, составило 4,66 мг/л (3,26 мл/л). После 10-минутной обработки аргоном при помощи предложенной установки содержание кислорода снижалось до 0,53 мг/л (0,37 мл/л), что составляет 10% от исходного значения (Ведунова М.В. c cоавт., 2012, Ведунова М. В. c cоавт., 2013).