Бакалавр
Дипломные и курсовые на заказ

Изучение свойств и эпитопный анализ аутоантител с помощью синтетических и рекомбинантных фрагментов ?1-адренорецепторов человека

Диссертация: Изучение свойств и эпитопный анализ аутоантител с помощью синтетических и рекомбинантных фрагментов ?1-адренорецепторов человека
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Исследовать влияние пространственных факторов на связывание аутоантител при помощи рекомбинантного химерного белка с фрагментом рецептора. Целью настоящей работы является изучение иммунохимических свойств и эпитопный анализ аутоантител к ?31 -адренорецепторам человека. Охарактеризовать аутоантитела к (31-адренорецепторам в сыворотке крови человека. С помощью разработанной тест-системы для… Читать ещё >

Содержание

  • Список сокращений
  • Глава 1. Обзор литературы
    • 1. 1. Р-Адренергические рецепторы сердца человека 7 1.1.1 .Роль (3-адренорецепторов в нейрогормональной передаче сигнала, классификация, адренорецепторы миокарда
      • 1. 1. 2. Механизмы функционирования (3-адренорецепторов
        • 1. 1. 2. 1. (З-Адренорецептор-опосредованная сигнальная система
        • 1. 1. 2. 2. Регуляция (3-адренорецепторов
      • 1. 1. 3. Структура (3-адренорецепторов
        • 1. 1. 3. 1. Общие сведения
        • 1. 1. 3. 2. Структура активного центра
        • 1. 1. 3. 3. Полиморфизм (3-адренорецепторов
    • 1. 2. (3-Адренорецепторы миокарда при хронической сердечной недостаточности '
      • 1. 2. 1. Патогенное воздействие на кардиомиоциты хронической активации симпато-адреналовой системы
      • 1. 2. 2. Изменения в |3-адренергической сигнальной системе кардиомиоцитов
    • 1. 3. Аутоиммунные реакции и сердечная недостаточность
    • 1. ААутоантитела к Р1 -адренорецепторам человека
      • 1. 4. 1. Свойства аутоантител in vitro
      • 1. 4. 2. Физиологическая роль аутоантител
      • 1. 5. Эглин С как вектор для экспрессии белков и пептидов
      • 1. 6. 3. аключение
  • Глава 2. Материалы и методы
    • 2. 1. Синтез пептидов
    • 2. 2. Получение рекомбинантного химерного белка эглин С-фрагмент pi-адренорецептора
    • 2. 3. Электрофорез в ПААГ по (Laemmli, 1970)
    • 2. 4. Аутоантитела к р1-адренорецепторам человека
    • 2. 5. Поликлональные антитела и конъюгаты
    • 2. 6. Моноклональные антитела и конъюгаты
    • 2. 7. Иммуноферментный анализ
    • 2. 8. Иммуноферментный анализ с использованием системы стрептавидин-биотин для иммобилизации пептида
    • 2. 9. Получение аффинных сорбентов с рекомбинантным химерным белком
    • 2. 10. Определение связывающей емкости аффинных сорбентов с химерным белком бетч-методом
    • 2. 11. Определение концентрации белков
  • Глава 3. Результаты и обсуждение
    • 3. 1. Взаимодействие аутоантител с химически синтезированными фрагментами второй внеклеточной петли (31 -адренорецептора
    • 3. 2. Взаимодействие аутоантител с рекомбинантным химерным белком
    • 3. 3. Характеристика аутоантител к (31 -адренорецептора в сыворотке крови человека
  • Выводы

Изучение свойств и эпитопный анализ аутоантител с помощью синтетических и рекомбинантных фрагментов ?1-адренорецепторов человека (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Р1 -Адренорецепторы, в частности, локализованные на кардиомиоцитах, относятся к семейству в белок-сопряженных рецепторов и участвуют в передаче сигналов от симпато-адреналовой системы. Связываясь с нейромедиатором — норадреналином, выделяемым симпатическими нервными окончаниями внутри миокарда, (31-адренорецепторы стимулируют аденилатциклазу, что приводит к накоплению ц-АМФ в кардиомиоците и, в конечном итоге, к усилению сократимости сердца. Передача сигнала осуществляется при участии О белков, в первую очередь Обсс.

Известно, что длительная активация (31 -адренорецепторов за счет повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция может приводить к перерождению кардиомиоцитов и развитию сердечной недостаточности. В ответ на повышенный синтез катехоламинов при сердечной недостаточности происходит также десенситизация (31-адренорецепторов кардиомиоцитов, что в конечном итоге приводит к дальнейшему прогрессирующему нарушению сократимости сердца. В последнее время полагают, что, помимо норадреналина, хроническую патогенную стимуляцию кардиомиоцитов могут вызывать и аутоантитела к (31-адренорецепторам, впервые выявленные при нарушении регуляции деятельности сердца. Предполагают, что такие антитела могут стабилизировать активное состояние рецептора и играть существенную роль в происхождении и развитии сердечной недостаточности.

Целью настоящей работы является изучение иммунохимических свойств и эпитопный анализ аутоантител к ?31 -адренорецепторам человека.

Для достижение этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Провести картирование антигенного эпитопа для аутоантител с помощью ряда химически синтезированных пептидов, соответствующих различным фрагментам второй внеклеточной петли рецептора.

2.Исследовать влияние пространственных факторов на связывание аутоантител при помощи рекомбинантного химерного белка с фрагментом рецептора.

3.Охарактеризовать аутоантитела к (31-адренорецепторам в сыворотке крови человека.

Выводы.

1. При картировании второй внеклеточной петли [31 -адренорецептора человека (197−222) с помощью химически синтезированных фрагментов установлено, что основным местом связывания аутоантител является последовательность (204−210).

2. С помощью рекомбинантного химерного белка с фрагментом рецептора показано, что вторая внеклеточная петля (31-адренорецептора человека не содержит дополнительных конформационных эпитопов для связывания аутоантител.

3. С помощью разработанной тест-системы для определения аутоантител к.

31-адренорецепторам на основе химически синтезированных и рекомбинантного фрагментов рецептора показано, что аутоантитела относятся к в и М иммуноглобулинам и являются низкоаффинными антителами.

Показать весь текст

Список литературы

  1. В.П., Осипов A.C., Шехтер И. И., Буленков М. Т. и др. Химический синтез гена ингибитора протеиназ (эглин С) без использования Т4-ДНК-лигазы и его экспрессия в E.coli. 1995- 21(№ 5): 354−358.
  2. Е.В., Тоневицкий А. Г., Рулева Н. Ю., Козлов И. А. Аутоиммунизация к адренергическим рецепторам миокарда, как фактор риска при операциях по поводу ишемической болезни сердца (ИБС). Бюллетень НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН, 2001, № 3, стр. 105.
  3. Красникова T. JL, Габрусенко С. А. ß--Адренергические рецепторы сердца в норме и при сердечной недостаточности. Успехи физиологических наук, 2000, № 2, стр.35−50.
  4. Н.Ю., Егорова Т. Г., Люкова Т. К., Домогатский С. П. Количественное определение иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови человека на микроколонках с иммобилизованным белком G. Депониров. В ЦМБ, № Д-25 058 от 19.03.1996.
  5. X., Клейст X. Определение аффинности антител. В кн. Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля. М., Медицина, 1987: 4257.
  6. Benovic J.L., DeBlasi A., Stone W.C., et al. |3-Adrenergic receptor kinase: primary structure delineates a multigene family. Science. 1989- 246: 235 240.
  7. Birnbaumer L., Abramowitz J., Brown A.M. Receptor-effector coupling by G proteins. Biochim Biophys.Acta. 1990, 1031: 163−224.
  8. Bourne H.R. How receptors talk to trimeric G proteins. Curr.Op.Cell Biol. 1997,9:134−142.
  9. Bradford M. A rapid and sensitive quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 1976- 72: 248−254. Braunwald E., Bristow M.R. Congestive heart failure: fifty years of progress. Circulation. 2000, 102: IV-14-IV-23.
  10. Bristow M.R., Hershberger R.E., Port J.D. et al. betal- and beta2-adrenergic receptor mediated adenylate cyclase stimulation in nonfailing and failing human ventricular myocardium. Mol.Pharmacol. 1989, 35: 295−303.
  11. Bristow M.R. Mechanism of action of beta-blocking agents in heart failure. Am.J.Cardiol., 1997, 80(11A): 26L-40L.
  12. Brodde O.E. betal and beta2-adrenoceptors in the human hearts: Properties, function, and alterations in chronic heart failure. Pharmacol.Rev.199i- 43: 203−242.
  13. Brodde O-E., Bouscher R., Tellkamp R., et al. Blunted cardiac responses to receptor activation in subjects with Thrl64Ile (^-adrenoceptors. Circulation. 2001- 103: 1048−1050.
  14. Caforio A.L.P., Stewart J.T., Bonifacio E., Burke M. et al. Inappropriate major histocompatibility complex expression on cardiac tissue in dilated cardiomyopathy. J.Autoimmun. 1990- 3: 187−200.
  15. Caforio A.L.P., Bonifacio E., Stewart J.T., Neglia D. et al. Novel organ-specific circulating cardiac autoantibodies in dilatted cardiomyopathy.
  16. J. Am.Coll.Cardiol. 1990a- 15: 1527−1534.
  17. Chien K.R. Genomic circuits and the intergrative diology of cardiac diseases. Nature. 2000- 407:227−232.
  18. Cetta F., Michels V. The autoimmune basis of dilated cardiomyopathy. Ann.Med. 1995,27: 169−173.
  19. Clark R.B., Kunkel M.W., Friedman J. Et al. Activation of cAMP-dependent protein kinase is required for heterologous desensitization of adenylyl cyclase in S49 wild-type lymphoma cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988- 85: 1442−1446.
  20. Dixon R.A.F., Sigal I.S., Candelore M.R., Register R.B. et al. Structural features required for ligand binding to the ?-adrenergic receptor. EMBO J. 1987- 6: 3269−3275.
  21. Dixon R.A.F., Sigal I.S., Rands E., Register R.B., et al. Ligand binding to the ?-adrenergic receptor involves its rhodopsin-like core. Nature. 1987a- 326: 73−77.
  22. Dohlman H.G., Caron M.G., Lefkowitz R.J. A family of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins. Biochemistry 1987, 26: 26 572 664.
  23. Dohlman H.G., Caron M.G., DeBlasi A., Frielle T. and Lefkowitz R.J. Role of extracellular disulfide-bonded systeines in the ligand binding function of the? j-adrenergic receptor. Biochemistry. 1990- 29: 2335−2342.
  24. Dorffel W.V., Felix S.B., Wallukat G., Brehme S. et al. Short-term hemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy. Circ. 1997- 95: 1994−1997.
  25. Dwyer M.A., Lu W., Dwyer J.J., Kossiakoff A.A. Biosynthetic phage display: a novel protein engineering tool combining chemical and genetic diversity. Chem. Biol. 2000- 7: 263−274.
  26. Elenkov I.J., Wilder R.L., Chrousos G.P., Vizi E.S. In: The sympathetic nerve an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system. Pharmacol. Rev. 2000- 52: 595−638.
  27. Feldman R.D. Adrenergic receptor polymorphysms and cardiac function (and dysfunction). Circulation .2001- 103: 1042−1043.
  28. Freedman N.J., Liggett S.B., Drachman D.E., Pei G., Caron M.G., Lefkowitz R.J. Phosphorilation and Desensitization of the Human P!-Adrenergic Receptor. J.Biol.Chem. 1995,270: 17 953−17 961.
  29. N.I. & Lefkowitz. Desensitization of G protein-coupled receptors. Rec.Progr.Horm.Res., 1996, 51: 319−353.
  30. Frielle T., Collins S., Daniel K.W., Caron M.G. et al. Cloning of the cDNA for the human pradrenergic receptor. Proc.Natl.Acad. Sci. 1987- 84: 7920−7924.
  31. Fraser C.M. Site-directed mutagenesis of P-adrenergic receptors. J.Biol.Chem. 1989- 264: 9266−9270.
  32. Fu L.X., Magnusson Y, Bergh C.H. et al. Localization of a functional autoimmune epitope on the muscarinic acetylcholine receptor-2 in patient with idiopathic dilated cardiomyopathy. J.Clin.Invest. 1993, 91: 1964−1968.
  33. Fukuta S, Yoshinaga T, Yamakawa K. et al. Dilated cardiomyopathy with special reference to humoral immunity. Jan. Circulation J., 1992, 56: 10 731 080.
  34. Gauthier C., Tavernier G., Charpentier F., Langin D., LeMarec H., Functional p3-adrenoceptor in the human heart. J.Klin.Invest. 1996, 98:556−562.
  35. Green S.A., Turki J., Innis M., et al. Ammo-terminal polymorphisms of the human beta 2-adrenergic receptor impart distinct agonist-promoted regulatory properties. Biochemistry. 1994- 33: 9414−9419.
  36. Hausdorff W.P., Caron M.G., Lefkowitz R.J. Turning off the signal: desensitization of |3-adrenergic receptor function. FASEB J. 1990- 4: 2881−2889.
  37. Hawthorn M.H., Broadley K.J. Evidence from use of neuronal uptake inhibition that 31 -adrenoceptors, but not (32-adrenoceptors, are innervated. J.Pharm.Pharmacol. 1982,34:664−666.
  38. Hopp T.P. and Woods K.R. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1981- 78: 3824−3828.
  39. Horsfall A.C., Rose L.M. Cross-reactive maternal autoantibodies and congenital heart block. J.Autoimmun. 1992, 5: 479−493.
  40. Jahns R., Boivin V., Siegmund Ch., Inselman G., Lohse M.J., Boege F. Autoantibodies activating human beta 1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 1999- 99: 649−654.
  41. Jahns R., Boivin V., Siegmund C. et al. Activating beta-1-adrenoceptor antibodies are not associated with cardiomyopathies secondary to valvular or hypertensive heart disease. J.Am.Coll.Cardiol. 1999a, 34: 1545−1551.
  42. Jahns R., Boivin V., Krapf T., Wallukat G. et al. Modulation of betal-adrenoceptor activity by domain-specific antibodies and heart failure-associated autoantibodies. J.Am.Coll.Cardiol. 2000, 36: 1280−1287.
  43. Jameson B.A. and Wolf H. The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput.Applic.Biosci. 1988- 4: 181.
  44. Jones D.T., Reed R.R. Molecular cloning of five GTP-binding protein cDNA species from rat olfactory neuroepithelium: the large and small forms of Gs and olfactory-specific G-protein, G off. J.Biol.Chem. 1987, 265: 4507−4514.
  45. Johnson M. The P-Adrenoceptor. Am.J.Respir.Crit.Care Med., 1998, 158: 146−153.
  46. Kaneko K., Kanda T., Yamauchi Y., Hasegawa A. et al. C-reactive protein in dilated cardiomyopathy. Cardiology 1999, 91: 215−219.
  47. Kuschel M., Zhou Y.Y., Spurgeon H.A., et al. P2-Adrenergic cAMP signalling is uncoupled from phosphorylation of cytoplasmic proteins in canine heart. Circulation. 1999- 99: 2458−2465.
  48. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London). 1970- 227: 680−685.
  49. Landzberg J.S., Parker J.D., Gauthier D.F., Colucci W.S. Effects of myocardial a 1-adrenergic receptor stimulation and blocade on contractility in humans. Circulation 1991, 84: 1608−1614.
  50. Liggett S.B. Beta (2)-adrenergic receptor pharcogenetics. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000- 161: S197-S201.
  51. Limas C.J., Goldenberg I.F., Limas C. Autoantibodies against beta-adrenoceptors in human idiopathic dilated cardiomyopathy. Circ.Res. 1989- 64: 97−103.
  52. Lu W.Y., Starovasnik M.A., Dwyer J.J., Kossiakoff A.A., Kent S.B., Lu W. Deciphering the role of the electrostatic interactions involving Gly70 in eglin C by total chemical protein synthesis. Biochemistry. 2000- 39: 3575−3584.
  53. Magnusson Y., Marullo S., Hoyer S., Andersson B., et al. Mapping of a functional autoimmune epitope on the beta 1-adrenergic receptor in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. J.Clin.Invest. 1990- 86: 1658−1663.
  54. Magnusson Y., Wallukat G., Waagstein F., Hjalmarson A., Hoebeke J. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization ofantibodies against the betal-adrenocepter with positive chronotropic effect. Circulation. 1994- 89: 2760−2767.
  55. Matsui S., Fu M.L.X., Katsuda S., et al. Peptides derived from cardiovascular G-protein-coupled receptors induce morphological cardiomyopathy changes in immunized rabbits. JMCC 1997- 51: 321−324.
  56. Maudsley S., Pierce K.L., Zamah A.M., et al. The ?32-adrenergic receptor mediates extracellular signal-regulated kinase activation via assembly of a multi-receptor complex with the epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem. 2000- 275: 9572−9580.
  57. Merrifield R.B. Solid phase peptide synthesis. I. J.Am.Chem.Soc. 1963- 85:2149−2154.
  58. Muller J., Wallukat G., Weng Y.-G., Dandel M. et al. Weaning from mechanical cardiac support in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. Circ. 1997- 96: 542−549.
  59. Naparstek Y., Plotz P.H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu.Rev.Immunol. 1993- 11: 79−104.
  60. Paque R., Gaunt C., Nealon T., Trousdale M. Assessment of cellmediated hypersensitivity against Coxsackie virus B3 indused myocarditisutilizing hypertonic sault extracts of cardiac tissue. J.Immunol. 1978, 120: 16 721 678.
  61. Pitcher J., Lohse M.J., Codina J., et al. Desnsitization of the isolated (32-adrenergic receptor kinase, cAMP-dependent protein kinase, and protein kinase C occurs via distinct molecular mechanisms. Biochemistry. 1993- 31: 3193−3197.
  62. Podlowski S., Wenzel K., Luther H.R., et al. (31-Adrenergic gene variations: a role in idiopathic dilated cardiomyopathy? J. Mol. Med. 2000- 78- 87−93.
  63. Reishaus E.M., Innis N., Maclntyre N., Liggett S.B. Mutations in the gene encoding for the (32-adrenergic receptor in normal and asthmatic subjects. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1993- 8: 334−339.
  64. Ristic A.D., Maisch B. Cardiac rhythm and conduction disturbances: what is the role of autoimmune mechanisms? Herz 2000, 25:181−188.
  65. Robishaw J.D., Smigel M.D., Gilman A.D. Molecular basis for two forms of the G protein that stimulates adenylate cyclase. J.Biol.Chem. 1986- 261: 9587−9590.
  66. Sabbah H.N. Apoptotic cell death in heart failure. Cardiovasc. Res. 2000, 45: 704−712.
  67. Sanderson J.E., Koech D., Iha D., Ojiambo H.P. T-lymphocyte subsets in idiopathic dilated cardiomyopathy. Am.J.Cardiol. 1985, 55: 755−758.
  68. Schulze K., Becker B.F., Schauer R et al. Antibodies to ADP-ATP carrier -an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy-impair cardiac function Circulation 1990, 81:959−969.
  69. Seemuller U., Eulitz M., Fritz H., Strobl A. Structure of the elastase-cathepsin G inhibitor of the leech Hirudo medicinalis. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1980- 361: 1841−1846.
  70. Staudt A., Schaper F., Stangl V. et al. Immunohistohemical changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorbtion therapy and subseguent immunoglobulin substituon. Circulation. 2001, 103: 2681−2686.
  71. Stiles G.L., Strasser R.H., Lavin T. N, Jones L. R et al. The cardiac ?-adrenergic receptor. J.Biol.Chem. 1983- 258: 8443−8449.
  72. Strader C.D., Candelore M.R., Hill W.S., Dixon R.A.F., Sigal I.S. Identification of two serine residues involved in agonist activation of the ?-adrenergic receptor. J.Biol.Chem., 1989, 264: 13 572−13 580.
  73. Strader C.D., Sigal I.S., Candelore M.R., Hill W.S., Dixon R.A.F. Conserved aspartic residues 9 and 113 of the ?-adrenergic receptor have different roles in receptor function. J.Biol.Chem., 1988, 263:10 267−10 271.
  74. Tota M.R., Candelore M.R., Dixon R.A.F., Strader C.D. Biophysical and genetic analysis of the ligand binding site of the beta-adrenoceptor. Trends Pharmacol. Sei. 1991- 12: 4−6.
  75. Turki J., Lorenz J.N., Green S.A., et al. Myocardial signaling defects and impaired cardiac function of a human beta 2-adrenergic receptor polymorphism expressed in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996- 93: 1 048 310 488.
  76. Ungerer M., Bohm M., Elce J., Erdman E., Lohse M.J. Altered expression of p-adrenergic receptor kinase and P-adrenergic receptors in the failing human heart. Circ.1993- 87: 454−463.
  77. Unites States Patent 5, 686, 564. Peptide derivatives corresponding to the carboxy terminal sequence of hirudin. 1997.
  78. Venter J.G., Fraser C.M., Harrison L.C. Autonantibodies to beta2-adrenergic receptors: a possible cause of adrenergic hyporesponsiveness in allergic rhinitis and asthma. Science 1980, 207: 1361−1363.
  79. Walker C.A., Spinale F.G. The structure and function of the cardiac myocyte: a review of fundamental concepts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999- 375−382.
  80. Wallukat G., Wollenberger A., Morwinski R., Pitschner H.F. Anti-betal-adrenoreceptor antibodies with chronotropic activity from the serum of patients with dilated cardiomyopathy. J.moI.Cell Cardiol. 1995, 27: 397−406.
  81. Wallukat G., Muller J., Podlowski S. et al. Agonist-like beta-adrenoceptor antibodies in heart failure. Am.J.Cardiol. 1999, 83(12A): 75H-79H.
  82. Xiao R.P., Lakatta E.G. pi-Adrenoceptor stimulation and P2-adrenoceptor stimulation differ in their effects on contradiction, cytosolic Ca2+, and Ca2+ current in single rat ventricular cells. Circulation. 1993- 73: 286−300.
  83. Xiao R.P., Avdonin P., Zhou Y.Y., et al. Coupling of P2-adrenoceptor to Gi proteins and its physiological relevance in murine cardiac myocytes. Circ.Res. 1999- 84: 43−52.
  84. Yoshikawa T., Port J.D., Asano K., Chidiak P. et al. Cardiac adrenergic receptor effects of carvediol. Eur: Heart J. 1996, 17(suppl. B): 8−16.
Заполнить форму текущей работой

Сдать сессию!