Выделение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и изучение возможности их использования в промышленности и сельском хозяйстве

Актуальность проблемы.

Фосфор (Р) является критически важным элементом для жизнедеятельности человека, широчайшим образом используется в разнообразных отраслях промышленности и для повышения продуктивности в сельскохозяйственном производстве. Как минеральный ресурс фосфор существует в виде нерастворимых рудных фосфатных соединений кальция, и в меньшей степени — алюминия и железа. Доказанных мировых запасов фосфатов имеется примерно на 60−80 лет, возрастание же спроса на фосфор вызвано как исчерпанием рентабельных месторождений, так и ростом потребности в продовольствии и экспоненциально возрастающим производством биотоплива [11, 36, 74, 102, 114]. В технологиях производства химических фосфоросодержащих продуктов, включая минеральные удобрения, важнейшим этапом является перевод труднорастворимых соединений фосфорной кислоты в растворимые формы. Фосфорную руду измельчают и обрабатывают сильными кислотами. При этом образуются летучие кислоты, жидкие и твердые отходы, которые сильно загрязняют окружающую среду. Производство Р-содержащих химических удобрений и других фосфорных соединений — энергоемкий и дорогой процесс. Кроме того, добыча и изготовление фосфорных удобрений' создают десятки миллионов тонн отходов бедных фосфатных руд, отходов фосфогипса и накопленных шламов на иловых полях, которые приводят к серьезному загрязнению окружающей среды. Так, отходы фосфогипса составляют приблизительно 4,1−5,4 тонны на тонну Р2О5. Остаточный фосфор, содержащийся в отходах, не извлекается для практических нужд по соображениям рентабельности [1, 74, 102,104, 126].

В сельском хозяйстве как основной отрасли, потребляющей фосфорные продукты, острая проблема дефицита доступного Р в почве решается путем регулярного внесения растворимых минеральных удобрений. Растворимость фосфорных удобрений имеет обратную сторону: только 10−25% вносимого с химическими удобрениями фосфора ассимилируется растениями, а большая часть фосфатов переходит в труднодоступную форму либо вымывается с грунтовыми водами. При этом в настоящий момент известные формы химических минеральных удобрений подошли (по показателям усвоения растениями и снижения потерь в окружающую среду) к своему пределу совершенствования, как в самом производстве, так и в применении продукта. Таким образом, низкая эффективность использования фосфора из существующих удобрений и возрастание потребностей сельского хозяйства при росте населения увеличивают глобальные экологические проблемы, возникающие при добыче/производстве и применении фосфорных удобрений, и ускоряют истощение невосполняемых месторождений богатых руд. Из-за высокой стоимости многие развивающиеся страны практически не используют химические фосфорные удобрения. В связи с этим встает вопрос о разработке более дешевых и эффективных фосфорных удобрений [13, 74, 101, 146].

Альтернативой для существующих химических методов извлечения Р и приготовления удобрений может служить процесс прямого микробиологического высвобождения (солюбилизации) фосфатов из нерастворимого сырья. Процесс основан на использовании метаболической активности фосфатсолюбилизирующих (ФС) культур, которые встречаются в природе в различных экологических нишах и способны медленно переводить нерастворимые фосфаты из Р-содержащих рудных материалов в растворимую форму в ходе своей жизнедеятельности [59, 137, 155]. Следует отметить, что отечественные исследователи являлись пионерами в изучении процессов микробной мобилизации фосфатов из нерастворимых соединений [26, 29]. В мире появились первые сельскохозяйственные препараты («1ишр81аЛ», КоуогушеБ, Дания и «Рг70», ЗвВ, Австралия), основанные на использовании ФСМ, что подтверждает дальнейшее развитие научного и промышленного интереса в этой области [163, 167]. Прямая микробная мобилизация фосфатов может быть применена шире, чем только в агротехнологиях, и в целом преимущества использования процесса можно представить как:

— «Зеленые» технологии использования нового поколения микробных удобрений, дополняющих или замещающих существующие химические;

— более эффективное использование исчерпаемого фосфорного сырья и снижение эвтрофикации окружающей среды (почв, грунтовых вод);

— возможность утилизации фосфатсодержащих отходов предприятий химической индустрии (фосфогипс, иловые осадки прудов-накопителей) и бедных руд с рекуперацией остаточного фосфора в индустриальном цикле;

— возможность улучшения экологической обстановки и снижение расходов по обеспечению безопасности на существующих производствах добычи/обогащения сырья и получения минеральных удобрений;

— относительная простота и малая энергоемкость технологического процесса изготовления биопрепаратов и экологических биотехнологий, что может обеспечить экономическую целесообразность внедрения новых процессов.

К сожалению, недостаточная изученность процессов микробной фосфатсолюбилизации (ФС), биоразнообразия фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов (ФСМ) и доступного разнообразия фосфатных руд, отсутствие технологических проработок, и, в целом, обширный междисциплинарный характер проблемы — не позволили к настоящему времени использовать процессы микробной ФС в достаточном спектре практических разработок.

В связи с этим, представляется актуальной разработка микробиологических и биотехнологических процессов, в которых будут использована способность микроорганизмов солюбилизировать фосфор для приготовления нового поколения биологических удобрений, а также в технологиях утилизации отходов фосфатной индустрии и извлечении остаточного фосфора.

Целью исследования являлись выделение активных ФСМ из различных экологических ниш и изучение возможности их использования для разработки биофосфорных удобрений и в процессах высвобождения фосфора из фосфатсодержащих бедных руд и отходов.

Задачи исследования:

1. Поиск и выделение активных ФС культур в широком спектре экологических ниш;

2. Характеризацию ФС изолятов, включая исследование ФС в модельных средах, ключевых метаболитов, биодоступности различного фосфатного сырья;

3. Изучение возможности применения выделенных ФСМ для создания технологии микробных фосфорных удобрений и ее экономическая оценка;

4. Исследование перспективы использования ФСМ для прямого извлечения фосфатов из фосфатсодержащих отходов, бедных руд.

Научная новизна. Впервые для поиска, выделения и оценки распространенности ФСМ был предложена и использована панель скрининга разнообразных экологических ниш и показано, что активные ФСМ эффективно выделяются не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород. Полученные результаты позволяют более глубоко понять процессы микробной ФС: выявлено значительное влияние компонентов питательной среды на состав метаболитов, обеспечивающих растворение фосфатов, с использованием широкого круга микроорганизмов детально изучен механизм высвобождения фосфатов с помощью группы глюконовых кислот, позволяющий наиболее эффективно использовать для этой цели углеродный субстрат. Изучена доступность спектра фосфорных руд отечественных и мировых месторождений воздействию отобранных наиболее активных микроорганизмов. Выявлено несколько групп фосфатного сырья, наиболее доступных для микробной фосфатсолюбилизации. Впервые показана возможность микробиологического высвобождения фосфатов низкой концентрации из фосфорсодержащих материалов: фосфогипса и рудных отходов.

Практическая значимость. Разработаны микробиологические и биотехнологические основы для использования процессов прямой микробной фосфатсолюбилизации в промышленности, сельском хозяйстве и природоохранных технологиях. Выделены культуры, способные к прямой микробной фосфатсолюбилизации из нерастворимого рудного сырья. Отобраны дляпрактического использования' наиболее перспективные штаммы, не уступающие или превосходящие по ряду свойств и ФС активности лучшие мировые аналоги. Разработаны лабораторные методики приготовления фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, выделения и селекции фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, лабораторные Регламенты производства фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и производства комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами. В Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск Московской обл.) депонированы два штамма ФСМ. Показано повышение урожайности зерновых и декоративных растений при использовании экспериментальных образцов биофосфорных удобрений. Отобраны наиболее биологически доступные группы фосфатного сырья, выбраны наилучшие по биодоступности отечественные фосфатные руды. Разработаны формоустойчивые волокнистые носители, позволяющие эффективно соиммобилизовать биомассу и сырье в процессе непрерывной обработки руд. Предложена технология использования ФО культур и ФС.

11 процессов для извлечения фосфатов из бедных руд и для утилизации фосфатсодержащих отходов промышленности (фосфогипса).

Внедрение результатов работы. Результаты исследований послужили основой для разработки научно-технической документации: Методики Лабораторной МИ 15.444−2002 «Приготовления фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов»,.

Лабораторного Регламента ЛР 1 927;15−82−2003 «На производство фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов», Лабораторного Регламента ЛР 78 095 326−77−2009 «На производство комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами» и Методики Лабораторной МЛ 78 095 326−007−2010 «Выделения и селекции фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов». Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности и других факультетов Пущинского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Активные фосфатсолюбилизирующие микроорганизмы могут эффективно выделяться не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород. •.

2. Поиск в разнообразных экологических нишах позволяет выделить штаммы, которые по своим ФС свойствам в модельной среде не уступают мировым аналогам, лучше их растворяют природное Р-сырье, а по технологическим и экономическим показателям могут превосходить.

3. Использование биоудобрений на основе выделенных ФСМ позволяет повысить количество и качество урожая.

4. Возможно создание технологии, позволяющей в непрерывном процессе с помощью фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов высвобождать фосфаты из низкосортных фосфоросодержащих материалов горнохимической индустрии: фосфогипса и рудных отходов.

5. Прямая микробная солюбилизация фосфатов из нерастворимого минерального сырья является эффективным микробиологическим процессом и перспективна для практического использования в различных отраслях.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУНГНЦПМБ 16 июля 2010 года.

Материалы диссертации доложены и представлены на 12 международных и российских научных конференциях: 8-м Европейском конгрессе по биотехнологии (17−21 августа 1997 г., Budapest, Hungary) — Международном конгрессе «Вода: экология и технология» (25−30 мая 1998 г., Москва, Россия) — Международном семинаре «Evaluation of sponsored biological studies in Russia for new millennium» (02−04 сентября 1999 г. Новосибирск, Россия) — Международной научной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (22−25 мая 2000 г., Оболенск, Россия) — Международном Форуме «Биотехнология и современность» (17−18 июня 2003 г., Санкт-Петербург, Россия) — Канадско-Российском Коллоквиуме по биологическим наукам (15−17 Сентября 2004 г., Москва) — 34-м Международном Семинаре Япония/Россия «Biotechnologies in Russia/CIS» (17 Июня 2005 г., Tokyo, Japan) — 3-м Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (14−18 марта 2005 г., Москва, Россия) — 3-м Международном Симпозиуме «Phosphate Dynamics in Soil-Plant Continuum» (14−19 мая 2006 г., Uberlandia, Brazil) — 10-й Международной Конференции «Soil-Water Systems Consoil-2008» (03−06 июня 2008 г., Milano, Italy) — Юбилейном Международном Симпозиуме МОББ «Биоценотическая регуляция. Основы современных фитосанитарных технологий» (21−25 мая 2007 г., Санкт-Петербург, Россия) — 2-м Международном Экологическом Форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (01−04 июля 2008 г., Санкт-Петербург, Россия).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 17 научных публикациях, включая 7 статей (в том числе 3 статьи, опубликованные в журналах, включенных в список ВАК) и патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 49 отечественных работ и 121 работу зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 56 рисунками и 34 таблицами.

выводы.

1. Изучено распространение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов в природных экологических нишах и выявлены новые ниши, сравнимые или превосходящие известные на сегодня по эффективности выделения целевых культур. Установлено, что активные ФСМ могут эффективно выделяться не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород.

2. В дополнение к методу зон просветления на плотных средах с нерастворимым фосфатом для выделения активных ФСМ предложен комплексный метод, включающий также использование жидких селективных сред.

3. Детально исследованы ФС свойства штамма В. cepacia Е-37, оптимизирована технология получения его биомассы, сделана экономическая оценка ее приготовления, показана его эффективность в составе опытного биоудобрения в полевых вегетационных экспериментах на ячмене. Отмечено, что технология приготовления его биомассы достаточно дорога и не дает устойчивых результатов.

4. Выделены и охарактеризованы штаммы, которые по своим ФС и технолого-экономическим свойствам превосходят один из лучших мировых аналогов В. cepacia Е-37 и перспективны для создания ФС препаратов и технологий.

5. Получены новые данные о существенном влиянии содержания источников питания, растворенных фосфатов, дозы ФСМ на эффективность протекания ФС.

6. Выявлены группы фосфатсодержащих руд, наиболее доступных воздействию микроорганизмов при использовании в ФС процессах.

7. В лабораторных вегетационных и мелкоделяночных испытаниях опытных образцов фосфорного биоудобрения подтверждена их эффективность: достоверно повышалась урожайность растений и содержание в них фосфора.

8. Разработана технология непрерывного высвобождения фосфатов из низкосортных фосфорсодержащих материалов на основе использования ФСМ. Эффективный непрерывный процесс высвобождения фосфатов был реализован за счет подбора носителей и соиммобилизации в них рудного сырья и ассоциации ФСМ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Приношу глубочайшую благодарность моим научным руководителям д.м.н., профессору И. А. Дятлову и к.б.н. Бикетову С. Ф. за высокий интерес к результатам этой работы, помощь в формировании научной концепции работы и неизменную систематическую поддержку в завершении труда.

Приношу искреннюю благодарность заведующему отделом биологических технологий, к.б.н. В. В. Перелыгину и с.н.с., к.х.н. С. К. Жиглецовой за идейное руководство, мудрую поддержку и большую помощь в организации технологических и биохимических исследований данной работы.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам и сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Приношу искреннюю признательность официальным и неофициальным рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В представленной работе рассмотрены современное состояние фосфорной индустрии и проблемы переработки Р сырья и применения продуктов. Исследованы современные данные в области микробной фосфатсолюбилизации, выделения активных штаммов ФСМ, механизма действия и возможного их применения.

В работе изучено распространение ФСМ в разнообразных экологических нишах и впервые показано, что активные ФСМ эффективно выделяются не только из ризосферной части растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород. Полученные результаты позволяют более глубоко понять процессы микробной ФС: выявлено значительное влияние компонентов питательной среды на состав метаболитов, обеспечивающих растворение фосфатов. Для выделенных по усовершенствованному методу культур определен наиболее распространенный механизм растворения фосфатов микроорганизмами через формирование группы глюконовых кислот. Отмечено, что некоторые коллекционные штаммы микроорганизмов проявляют ФСА. Изучена доступность разнообразных фосфорных руд отечественных и мировых месторождений воздействию отобранных наиболее активных микроорганизмов. Выявлено несколько групп фосфатного сырья, наиболее биодоступных микробной фосфатсолюбилизации. Впервые показана возможность высвобождения фосфатов низкой концентрации из фосфоросодержащих материалов: фосфогипса и рудных отходов.

Работа имеет высокую практическую значимость. На основе обширной экспедиционной работы по обследованию разнообразных экологических ниш и климатических регионов РФ/СНГ выделены культуры, способные к прямой микробной фосфатсолюбилизации из нерастворимого рудного сырья. Модифицирована методология селекции активных ФС культур, перспективных для использования в промышленности и сельском хозяйстве, за счет использования контроля ФС в жидких средах, что позволило дополнительно селекционировать на 25−50% высокоактивных ФСМ. Отобраны для практического использования наиболее перспективные штаммы, не уступающие или превосходящие по ряду свойств и ФСА лучшим из описанных культурам. В коллекцию живых культур ФГУН ГНЦПМБ депонированы два штамма ФСМ.

На примере наиболее активных из известных в литературе штаммов показано, что наиболее эффективно высвобождают фосфаты штаммы, стехиометрически окисляющие глюкозу до глюконовой и кетоглюконовой кислот. При этом глюкоза сначала полностью окисляется в эти кислоты, которые вызывают растворение фосфатов и начинают усваиваться микроорганизмами только после окисления всей глюкозы в среде. Соответственно, до полного превращения глюкозы в кислоты не происходит размножения клеток. В отсутствие растворимых фосфатов для таких микроорганизмов глюкоза, по-видимому, является ингибитором размножения.

При использовании в биофосфорном удобрении микроорганизмов, осуществляющих растворение фосфатов по вышеуказанному механизму, можно точно рассчитать соотношение фосфатной руды и источника углерода, что позволит использовать вводимые в биофосфорное удобрение компоненты наиболее эффективно. Вводимое в удобрение количество клеток будет определять время «работы» такого препарата в почве.

Проведена технологическая оптимизация приготовления биомассы для 2 ФС культур и связанный с этим экономический расчет стоимости биомассы. Показано, что вновь выделенный штамм ФС, растущий на минеральных средах имеет низкую себестоимость и перспективен для создания препарата биоудобрения. Показано повышение урожайности зерновых и цветочных растений при использовании экспериментальных образцов биофосфорных удобрений.

Отобраны наилучшие по биодоступности отечественные фосфатные руды, отобраны наиболее биологически доступные группы фосфатного сырья. Для различных групп фосфорного сырья показано наилучшее высвобождение фосфатов ФС культурами из морских фосфоритов шельфового залегания, из зернистых и желваковых фосфоритов. Разработана технология использования ФС культур и ФС процессов для извлечения фосфатов из бедных руд и для утилизации фосфат-содержащих отходов промышленности (фосфогипса).

В целом, разработаны микробиологические и биотехнологические основы для использования процессов прямой микробной фосфат-солюбилизации в промышленности, сельском хозяйстве и экологии.