Назначение, классификация и критерии выбора флуоресцентных зондов

Имеют место требования к флуоресцирующему хромофору, которые накладывают ограничения на применимость метода флуоресцентного зондирования. При выборе зонда исследователю следует убедиться в том, что область поглощения выбранного хромофора не перекрывается с областями поглощения компонентов изучаемого биосубстрата, при этом не должно происходить никакого влияния на свойства самого биообъекта со стороны ФЗ. Необходимым условием является различие в параметрах флуоресценции для свободного и связанного зонда, а также соблюдение условий передачи энергии возбуждения в донорно-акцепторной паре.

В настоящее время насчитывается не менее 200 соединений — флуоресцентных зондов, которые условно делятся на три группы в зависимости от величины дипольного момента и наличия заряженных частиц. Для групп будет наблюдаться различное расположение зонда в субстрате: гидрофобные и амфифильные зонды будут различно локализовываться на поверхности раздела биосубстрат-растворитель. Основываясь на этом, происходит отбор необходимых молекул-зондов в зависимости от цели и объекта исследования. Важно отметить, что при использовании в биологии и биофизике ФЗ подбираются таким образом, чтобы они имели возможность связываться с белками в наиболее активных центрах.

Одним из наиболее важных предпосылок чувствительности зонда к окружению является его применение для изучения биологических структур (мембраны, белки, иные компоненты клетки), с которыми ФЗ связывается нековалентными связями. Интенсивность и время жизни флуоресценции зонда характеризуют подвижность сольватной оболочки, поляризация флуоресценции — вращательную подвижность, ориентацию и вязкость микроокружения зонда.

По эффективности переноса энергии от зонда-донора к зонду-акцептору, находящихся по разные стороны от биологической мембраны, решается задача о нахождении её толщины. Флуоресцентные методы, с использованием зондов, позволяют решить ряд задач клинической диагностики (флуоресцентная эндоскопия), экологического контроля и физико-химического анализа.

В настоящее время известно достаточно большое число соединений, которые применяются в качестве ФЗ. Среди них: 1-анилинонафталин-8-сульфонат (1,8-АНС), пирен, перилен, 4-(n-диметиламиностирил)-N-метилпиридиния (ДСМ), толуинонафталин сульфонат (ТНС), n-толуолсульфонат 4-(n-диметиламиностирил)-1-гексилпиридиния (ДСП), пирен, дифенилгексатриен (ДФГ), 3-метоксибензантрон (МБА), Auramine O, 4-диметиламинохалкон (ДМХ), 6-додеканоил-2-диметиламинонафталин (ЛАУРДАН / LAURDAN), 6-пропинил-2-диметиламинонафталин (ПРОДАН / PRODAN), 2-диметиламинoнафталин (ДАН / DAN), перилен и др.

В настоящее время наиболее применяемыми в биохимических и биофизических исследованиях являются молекулы ЛАУРДАН и ПРОДАН. Эти молекулы в своей основе являются производными нафталина.

Рис. 2. Структура молекулы ЛАУРДАН

Интерес к выбранным молекулам объясняется экстремально-большим сдвигом в спектрах флуоресценции и большим изменением величины квантового выхода флуоресценции при смене полярности растворителя. Практическое применение изучаемых зондов связано с их многоцентровостью к образованию комплексов с растворителями.

Рис. 3. Структура молекулы ПРОДАН